PEWARNAAN WRIGHT: ALASAN, BAHAN, TEKNIK, DAN PENGGUNAAN - BIOLOGI - 2025

The Wright noda adalah teknik pewarnaan yang diciptakan oleh Amerika patologi James Homer Wright pada tahun 1902, berdasarkan noda Romanowsky. Karena noda Romanowsky tidak stabil, Wright memasukkan metanol sebagai pelarut dan fiksatif.

Pewarnaan ini bersifat polikromatik, artinya menghasilkan beberapa warna tergantung dari struktur yang menyerap pewarna. Teknik pewarnaan ini telah banyak digunakan untuk melakukan penghitungan sel darah putih diferensial dan untuk mempelajari morfologi sel darah merah, trombosit, dan leukosit dalam darah tepi dan sumsum tulang.

Berbagai noda darah tepi diwarnai dengan noda Wright. A. Leukemia akut B. Plasmodium vivax di dalam eritrosit. C. Plasmodium falciparum, makrogametosit. D. Limfosit

Penerapannya sangat penting, karena kelainan dapat dilihat pada berbagai jalur sel darah, memfasilitasi diagnosis penyakit seperti leukemia atau infeksi bakteri atau parasit.

Mungkin ini adalah aplikasi paling umum di mana teknik ini digunakan, namun itu bukan satu-satunya. Ini juga berguna dalam sampel selain darah dan sumsum tulang, seperti cairan hidung, lendir feses, dahak, sampel kulit, dan lain-lain.

Dasar pemikiran noda Wright

Pewarnaan Wright lahir dari pewarnaan Romanowsky, yang terdiri dari larutan metil alkohol dari pewarna asam (eosin Y) dan pewarna dasar (biru metilen) dan produk oksidasinya.

Campuran pewarna yang digunakan dalam pewarnaan Wright menyebabkan efek yang disebut Romanowsky, yaitu memberikan warna ungu yang indah pada inti leukosit dan butiran neutrofilik, sedangkan sel darah merah berwarna merah jambu.

Komponen yang bertanggung jawab untuk memberikan gamut warna khas pewarnaan Wright adalah biru B dan eosin Y. Efek yang diamati akan bergantung pada pengikatan pewarna ke struktur kimia dan interaksi biru B dan eosin Y.

Struktur asam seperti asam nukleat, protein inti, dan sitoplasma imatur reaktif dari beberapa jenis sel, memfiksasi B biru (pewarnaan dasar).

Sedangkan struktur dasarnya seperti hemoglobin, butiran eosinofil tersegmentasi, antara lain struktur seluler, mengikat eosin Y (zat warna asam).

Hasil pewarnaan dapat dipengaruhi oleh berbagai faktor, seperti pH pewarna Wright, buffer dan larutan pencuci; serta waktu pewarnaan dan fiksasi.

Oleh karena itu, setiap tahap dalam pembuatan reagen sangat penting dan harus dilakukan dengan memperhatikan setiap detail.

bahan

Noda Wright. Untuk 100 mL dibutuhkan:

Timbang 0,3 g pewarna Wright, ukur 97 ml metanol dan 3 ml gliserol.

Persiapan

Di dalam lumpang, masukkan pewarna Wright dalam jumlah banyak dan secara bertahap masukkan gliserol sampai bubuknya benar-benar larut.

Selanjutnya methanol ditambahkan, dicampur dan dituang ke dalam botol amber.

Sebelum digunakan, solusinya harus dikocok dengan gerakan lembut dan disaring.

Larutan buffered

Dalam satu liter air suling, 3,76 g disodium hidrofosfat (Na ₂ HPO ₄ 2H ₂ 0) ditambah 2,1 g dihidrogen kalium fosfat (KH ₂ PO ₄ ) ditambahkan.

Aduk rata sampai semua reagen yang digabungkan larut. Sesuaikan pH menjadi 7,2. Tuang ke dalam toples kaca dan simpan pada suhu kamar.

Bahan tambahan yang dibutuhkan untuk melakukan pewarnaan

Selain itu, bahan-bahan lain yang dibutuhkan untuk dapat melakukan teknik pewarnaan, antara lain: perosotan atau penutup benda, jembatan pewarnaan, kaos dengan air atau penyangga untuk mencuci, timer untuk menjaga waktu pewarnaan dan beberapa bahan pengeringan. (kertas penyerap, kain kasa atau kapas).

Komponen noda Wright

Metanol

Alkohol (metanol) berfungsi sebagai fiksatif apusan darah ke kaca objek.

Ini pada dasarnya adalah reagen pereduksi, dehidrasi, dan penguat koagulan. Oleh karena itu, fungsinya adalah untuk membekukan protein dan membuatnya tidak larut, tetapi tanpa benar-benar mengubah sifatnya.

Metanol adalah reagen fiksasi smear yang paling banyak digunakan di semua laboratorium, karena memberikan hasil yang lebih baik daripada etanol. Konsentrasi ideal adalah 99%.

Damper

Buffer (larutan buffer) memiliki fungsi untuk mengatur atau menjaga pH zat warna, karena pH yang disesuaikan dengan 7,2 sangat penting agar struktur sel dapat menyerap zat warna dengan baik.

Di sisi lain, langkah fiksasi metanol mendehidrasi sel dan buffer membantu merehidrasi sel.

Eosin (Y)

Eosin memiliki afinitas untuk blok bangunan karena merupakan pewarna asam. Dua jenis eosin diketahui sangat mirip satu sama lain, sedemikian rupa sehingga salah satu dari keduanya dapat digunakan, memperoleh hasil yang sama.

Salah satunya disebut eosin Y, eosin kuning, atau tetrabromofluorescein, dan yang lainnya disebut eosin B, eritrosin B kebiruan, atau dibromodinitrofluorescein. Namun, eosin Y adalah yang paling umum digunakan.

Sifat terpenting pewarna ini adalah polaritas negatifnya, ini membuatnya tertarik pada struktur sel yang bermuatan positif.

Metilen biru

Itu adalah pewarnaan dasar. Sifat utamanya adalah metachromasia, yaitu tidak semua struktur akan diwarnai dengan warna yang sama, itu tergantung pada komposisi kimia dari struktur yang diwarnai.

Beberapa akan berubah menjadi biru muda atau tua, dan beberapa akan berubah menjadi ungu tua atau ungu pucat.

Teknik

1-Lakukan penyebaran sampel sehingga film tipis tetap ada, baik pada kaca objek maupun penutup.

2-Biarkan mengering di udara selama kurang lebih 2 jam.

3-Tempatkan noda kering pada jembatan pewarnaan atau nampan pewarnaan dengan penyebaran sampel menghadap ke atas.

4-Tutupi lembaran dengan noda Wright setetes demi setetes sampai seluruh permukaan tertutup. Biarkan selama 5 - 8 menit.

5-Noda harus menutupi slide sepenuhnya, tanpa tumpah ke tepinya. Jika selama pewarnaan mulai menguap, tambahkan beberapa tetes lagi.

6-Selanjutnya tambahkan jumlah yang sama dari peredam kejut, tiup sedikit sampai kilau logam yang khas muncul. Waktu 10 sampai 15 menit.

7-Cuci dengan air keran, alirkan perlahan sampai seprai tampak merah muda.

8-Dengan kain kasa yang dibasahi alkohol, bersihkan pewarna yang menempel di bagian belakang kaca geser.

9-Biarkan noda mengering dengan baik sebelum menempatkan minyak imersi untuk melihatnya di bawah mikroskop.

Utilitas

Hematologi

Ini sangat ideal untuk pewarnaan apusan darah tepi, untuk pemeriksaan apusan darah kental dan untuk studi sel dari sampel sumsum tulang.

Karena sifat kimia dari kombinasi pewarna ini, struktur sel dapat dengan mudah dikenali, dan berbagai jenis sel yang ada dapat dibedakan.

Pilek

Teknik ini sangat berguna untuk mengidentifikasi sel-sel cairan hidung (sel epitel, eosinofil tersegmentasi, sel polimorfonuklear) dalam diagnosis rinitis alergi.

parasitologi

Dalam hal ini, penelitian Leishmania sp dalam histiosit jaringan seluler subkutan pada ulkus kulit telah berguna. Demikian juga, digunakan untuk mengidentifikasi leukosit dalam sampel tinja (leukogram tinja).

Dalam hal ini, penting bagi dokter untuk mengetahui apakah leukositosis yang ada dalam tinja adalah polimorfonuklear atau mononuklear. Temuan dalam leukogram tinja ini akan memandu apakah itu infeksi bakteri atau virus.

Di sisi lain, parasit yang beredar di dalam darah dapat ditemukan di dalam eritrosit atau bebas di dalam plasma. Parasit yang dicari adalah Plasmodium spp, Trypanosoma cruzii dan filarias, dan dalam kedokteran hewan berguna untuk mencari Theileria equi dan Babesia caballi, agen penyebab bebesiosis, khususnya pada kuda.

Pewarnaan Wright dan pewarnaan Giemsa memungkinkan untuk membedakan hemoparasit dari komponen seluler normal. Dua jenis spread dapat digunakan untuk ini:

Oleskan tipis-tipis

Darah disebarkan sebagai lapisan tipis pada slide. Ini diwarnai dengan noda Wright, mengungkapkan karakteristik inti dan sitoplasma.

Penurunan tebal

Metodologi ini digunakan untuk menyelidiki keberadaan parasit dalam lebih banyak darah.

Untuk melakukan ini, setetes besar darah ditempatkan pada slide. Sesampai di sana, itu harus didefibrilasi, membuat lingkaran yang lebih besar dan lebih besar dari tengah ke luar, menggunakan tepi slide lain.

Terakhir, untuk dapat mengamati parasit pada apusan kental, eritrosit harus dilarutkan dengan air.

Infeksi saluran pernafasan

Pada tingkat pernafasan, teknik ini juga berguna, karena sel-sel yang terdapat dalam sampel sputum, lavage bronkial atau bronchoalveolar, penting untuk menegakkan diagnosis.

Demikian pula, sel polimorfonuklear dan sel mononuklear dapat dibedakan di sini.

Bakteriologi

Penggunaan teknik ini dalam bakteriologi terbatas, karena tidak baik untuk pewarnaan bakteri, oleh karena itu teknik pewarnaan khusus lainnya digunakan untuk pewarnaannya.

Namun, ini telah digunakan untuk mencari sel epitel dengan badan inklusi Chlamydia trachomatis dalam apusan mukosa uretra atau endoserviks, meskipun harus diakui bahwa ini bukan metode terbaik untuk ini.

Dimungkinkan juga untuk mengamati bakteri seperti spiral seperti Borrelia burgdorferi di antara sel darah merah pada pasien yang terinfeksi, serta morula atau badan inklusi Ehrlichia sp dalam sitoplasma limfosit, monosit, atau neutrofil dalam apusan darah.

Ilmu jamur

Histoplasma capsulatum adalah jamur patogen yang sering didiagnosis melalui pengamatan mikroskopis pada berbagai sampel jaringan yang diwarnai dengan pewarnaan Wright.

Bagaimana struktur sampel darah diamati dengan pewarnaan Wright?

Sumber: Retamales E, Mazo V. Institute of Public Health, Pemerintah Chili. Rekomendasi untuk pewarnaan apusan darah untuk membaca hemogram.

Rekomendasi untuk pewarnaan yang baik

Slide sampel darah harus mengering secara spontan. Pewarnaan harus setipis mungkin untuk mendapatkan fiksasi pewarna yang lebih baik dan menghindari pewarnaan yang berlebihan.

Untuk pewarnaan berkualitas tinggi, disarankan untuk melakukan pewarnaan dalam waktu dua jam setelah pembuatan smear. Di sisi lain, sampel yang ideal adalah darah kapiler, tanpa antikoagulan.

Namun, jika darah vena digunakan, itu harus digunakan sebagai EDTA antikoagulan dan bukan heparin, karena heparin dapat merusak struktur sel.

Untuk menghindari kerusakan pewarna yang disiapkan, harus disimpan di tempat yang kering.

Selama proses pencucian dianjurkan penggunaan air yang diatur dengan pH netral.

Akhirnya, disarankan untuk menguji metode pewarnaan yang digunakan di laboratorium dari waktu ke waktu.

Ini dilakukan dengan pewarnaan sampel atau pola yang diperluas, sebagai kontrol kualitas. Langkah ini penting, karena memastikan pewarnaan disiapkan dengan benar dan waktu pewarnaan distandarisasi dengan baik.

Jika lembar pola berwarna buruk, maka ada masalah yang harus diselesaikan.

Kesalahan umum dalam pewarnaan Wright

Pewarnaan sangat pucat

Noda yang sangat pucat biasanya disebabkan oleh waktu pewarnaan yang sangat singkat atau pencucian yang berlebihan. Ini dikoreksi dengan memperpanjang waktu kontak dengan pewarna atau mengurangi waktu pencucian.

Pewarna mengendap

Adanya endapan zat warna dalam apusan dapat disebabkan oleh beberapa hal, namun penyebab yang paling sering adalah: penggunaan zat warna yang tidak difilter, pewarnaan pada jembatan pewarnaan yang tidak rata, menggunakan lembaran yang kotor dengan debu atau minyak, tidak dicuci dengan baik pewarnaan lengkap.

Corengan yang sangat merah atau biru

Buffer bertanggung jawab atas pH pewarna. Pewarna dengan pH di bawah yang diindikasikan (asam) akan menghasilkan noda yang sangat kemerahan.

Jika pH pewarna di atas (basa) akan diperoleh noda yang sangat kebiruan.

Mode penyimpanan

Reagen harus disimpan pada suhu kamar.

Referensi

1. Gutiérrez V. Studi perbandingan antara metode pewarnaan Wright dan tes Elisa untuk diagnosis Ehrlichiosis anjing di kota San Pedro Sula, Honduras. 2008. Gelar Tesis untuk memenuhi syarat untuk Gelar Kedokteran Hewan. Universitas San Carlos dari Guatemala.
2. López-Jácome L, Hernández-Durán M, Colín-Castro C, Ortega-Peña S, Cerón-González G, Franco-Cendejas F. Pewarnaan dasar di laboratorium mikrobiologi. Penelitian di Disabilitas. 2014; 3 (1): 10-18.
3. "Noda Wright." Wikipedia, ensiklopedia gratis. 18 Mei 2018, 12:05 UTC. 8 Des 2018 pada 20:37
4. Calderon A, Cardona J, Vergara Ó. Frekuensi Babesia spp. dalam berburu kuda, Córdoba (Kolombia). Pdt. Udcaactual divulg cient. 2013; 16 (2): 451-458.
5. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A (2009). Diagnosis Mikrobiologis Bailey & Scott. 12 ed. Argentina. Editorial Panamericana SA
6. Retamales E, Mazo V. Institut Pemerintah Kesehatan Masyarakat Chili. Rekomendasi untuk pewarnaan apusan darah untuk membaca hemogram.