PEWARNAAN GRAM: ALASAN, BAHAN, TEKNIK DAN PENGGUNAAN - BIOLOGI - 2025

The pewarnaan Gram adalah yang paling sederhana dan paling berguna pewarnaan teknik dalam mikrobiologi diagnostik. Teknik ini diciptakan oleh dokter Denmark Hans Christian Gram pada tahun 1884, yang berhasil mengklasifikasikan bakteri sebagai Gram positif dan Gram negatif, sesuai dengan komposisi dinding selnya.

Teknik ini mengalami modifikasi tertentu oleh Hucker pada tahun 1921 untuk menstabilkan reagen dan meningkatkan kualitas pewarnaan, itulah sebabnya pewarnaan Gram juga dikenal sebagai Gram-Hucker.

Berbagai noda diwarnai dengan pewarnaan Gram. A. cocci gram positif. B. batang Gram negatif. C. Gram-positif, polimorfonuklear dan basil mononuklear. D. Ragi.

Dengan teknik ini dimungkinkan juga untuk mengamati bentuk mikroorganisme, yaitu kokus, basil, coccobacilli, pleomorfik, berserabut, dan lain-lain. Serta distribusinya di ruang: dalam cluster, dalam rantai, terisolasi, berpasangan, dalam tetrad, dll.

Jika dicurigai adanya infeksi bakteri, sebagian besar sampel yang diterima harus diolesi pada kaca objek dan pewarnaan Gram untuk pemeriksaan mikroskopis.

Laporan Gram akan memandu dokter tentang jenis mikroorganisme yang mungkin menjadi penyebab infeksi, sebelum mendapatkan hasil kultur akhir.

Dalam beberapa kasus nyawa pasien sangat terganggu, oleh karena itu dokter sangat membutuhkan laporan Gram untuk melakukan pengobatan empiris, sambil menunggu identifikasi mikroorganisme tersebut.

Misalnya, jika Gram menunjukkan adanya Gram positif cocci dalam cairan serebrospinal, dokter akan memandu terapi awal dengan antibiotik yang menghilangkan jenis bakteri ini, sesuai dengan protokol yang ditetapkan untuk ini.

Setelah hasil akhir muncul dengan nama mikroorganisme yang diisolasi dan antibiotikogramnya masing-masing, dokter akan mengevaluasi apakah akan mengubah terapi atau tidak. Keputusan ini akan dibuat sesuai dengan studi kerentanan mikroorganisme terhadap antibiotik yang diterimanya dan evolusi pasien.

Dasar

Ini adalah teknik yang memiliki 4 langkah dasar: pewarnaan, fiksasi dengan mordan, perubahan warna dan pewarnaan. Oleh karena itu, teknik ini selain mewarnai bakteri juga memungkinkan untuk dibedakan.

Crystal violet adalah pewarna pertama yang digunakan. Ia memiliki afinitas untuk peptidoglikan dan akan menodai semua bakteri yang ada menjadi ungu, kemudian lugol ditempatkan, yang bertindak sebagai mordan, yaitu, akan menginduksi pembentukan kompleks kristal violet-iodine kristal yang tidak larut - protein ribonuklear di dalam sel. .

Bakteri gram positif, memiliki dinding peptidoglikan yang tebal, membentuk lebih kompleks (kristal violet-iodin), oleh karena itu tetap mempertahankan pewarna.

Selain itu, hal ini juga mempengaruhi bahwa dinding bakteri Gram positif mengandung lebih banyak asam tak jenuh, yang menunjukkan afinitas yang tinggi terhadap zat pengoksidasi (Lugol).

Sementara itu, bakteri Gram negatif memiliki lapisan peptidoglikan yang tipis, yang menyebabkan bakteri membentuk kompleks yang kurang dari bakteri Gram positif.

Kemudian tibalah tahap perubahan warna, di mana bakteri Gram positif dan Gram negatif berperilaku berbeda.

Bakteri gram negatif mengandung membran luar yang kaya akan lipopolisakarida yang merupakan bagian dari dinding selnya. Lemak dihancurkan melalui kontak dengan alkohol aseton, sehingga membran luar menjadi tidak stabil, melepaskan kristal violet.

Ini adalah bagaimana kemudian dilawan dengan safranin atau fuchsin dasar, berubah menjadi merah.

Dalam kasus bakteri Gram positif, mereka menolak memudar karena pemutih bekerja dengan menutup pori-pori, mencegah kristal violet / iodine complex bocor.

Oleh karena itu, pewarnaan dengan kristal violet tetap stabil, dan tidak ada ruang untuk safranin atau fuchsin. Inilah mengapa bakteri ini berwarna biru tua atau ungu.

bahan

Set pewarnaan Gram terdiri dari:

• Kaca ungu
• Lugol
• Alkohol aseton
• Safranin atau fuchsin dasar

Persiapan pewarna dan reagen

Larutan kristal violet

Solusi untuk:

Kristal ungu ------------- 2 gr

Etil alkohol 95% ----------- 20cc

Solusi B:

Amonium oksalat ----------- 0,8 gr

Air suling ------------- 80 cc

Untuk persiapan akhir kristal violet, larutan A harus diencerkan 1:10 dengan air suling dan dicampur dengan 4 bagian larutan B. Campuran disimpan selama 24 jam sebelum digunakan. Saring ke dalam botol pewarna kuning menggunakan kertas saring.

Jumlah yang akan digunakan setiap hari ditransfer ke botol penetes amber.

Iodo-Lugol

Timbang dan ukur jumlah yang ditunjukkan dari setiap senyawa, sebagai berikut:

Kristal yodium ------------- 1gr

Kalium iodida ------------- 2gr

Air suling ------------- 300 cc

Kalium iodida larut sedikit demi sedikit di dalam air dan kemudian ditambahkan yodium. Solusinya dicukur menjadi botol kuning.

Jumlah yang akan digunakan setiap hari ditransfer ke botol kuning yang lebih kecil dengan pipet.

Pemutihan

95% Etil Alkohol -----------– 50 ml

Aseton ------------------ 50 ml

Itu disiapkan di bagian yang sama. Tutupi dengan baik, karena cenderung menguap.

Tempatkan di botol penetes.

Persiapan ini memberikan perubahan warna dalam waktu sedang 5-10 detik dan paling direkomendasikan.

Pemula lebih suka menggunakan hanya 95% etil alkohol, yang memudarkan lebih lambat dari 10 hingga 30 detik.

Sedangkan yang lebih berpengalaman bisa menggunakan aseton murni, dimana perubahan warna terjadi sangat cepat dari 1 sampai 5 detik.

Kontras

Solusi Saham Safranin

Safranina -------------– 2.5 gr

Etil alkohol 95% --------– 100 cc

Setelah ditimbang jumlah safranin yang ditunjukkan, dilarutkan dalam 100 ml etil alkohol 95%.

Solusi safranin yang berfungsi disiapkan dari larutan stok.

Untuk melakukan ini, ukur 10 cc larutan stok, tambahkan 90 cc air suling untuk membuat 100 ml.

Dianjurkan untuk mentransfer jumlah yang akan digunakan setiap hari ke botol amber dengan pipet.

Mikroorganisme yang menodai Gram-negatif lemah dengan pewarnaan Gram-Hucker, seperti anaerob tertentu, Legionella sp, Campylobacter sp, dan Brucella sp, dapat diwarnai jauh lebih baik menggunakan modifikasi Kopeloff dari pewarnaan Gram-Hucker, disebut pewarnaan Gram-Kopeloff.

Teknik ini mengubah pewarna safranin menjadi fuchsin dasar. Dengan modifikasi ini dimungkinkan untuk mewarnai mikroorganisme tersebut secara efektif.

Penyimpanan reagen

Pewarna yang sudah disiapkan harus disimpan pada suhu kamar.

Pembuatan smear sampel yang akan diwarnai

Sampel harus mengandung setidaknya 10 ⁵ mikroorganisme sebelum pengamatan mikroorganisme di smear adalah kemungkinan. Apusan dapat dibuat dari sampel langsung atau dari kultur dalam media padat atau cair.

Apusan harus seragam, terdistribusi dengan baik dan tidak terlalu tebal, untuk visualisasi yang lebih baik dari struktur yang ada.

-Gram sampel langsung

Gram urin yang tidak disentrifugasi

Urine dicampur dan 10 µl ditempatkan pada slide. Pengamatan minimal satu bidang bakteri / Dip menunjukkan adanya infeksi.

Ini berarti bahwa biakan akan memiliki lebih dari 100.000 CFU / ml (10 ⁵ CFU / mL) urin dalam 85% kasus.

Metode ini tidak berguna untuk jumlah koloni di bawah 100.000 CFU.

CSF Gram

CSF harus disentrifugasi, supernatan dihilangkan, dan pelet disebarkan pada slide. Cairan ini steril dalam kondisi normal; pengamatan bakteri menunjukkan infeksi.

Gram sampel pernapasan

Sputum, bronkial atau bronchoalveolar lavage Gram, meskipun mungkin terdapat berbagai mikroorganisme, akan selalu memandu diagnosis, selain berguna untuk jenis sel yang diamati.

Dalam kasus sputum, apusan harus dibuat dengan bagian sampel yang paling purulen.

Gram tinja

Tidak disarankan untuk melakukan Gram pada sampel jenis ini, karena tidak memiliki nilai diagnostik.

-Gram tanaman

Mereka dapat dilakukan dengan dua cara, satu dari kultur cair dan yang lainnya dari kultur padat.

Kultur cair

Dari kultur cair, ini sangat sederhana; Beberapa daging panggang dari kaldu keruh diambil di bawah pembakar dan ditempatkan pada slide yang bersih dan kering, membuat gerakan melingkar dari tengah menuju pinggiran, untuk mendistribusikan bahan secara merata.

Biarkan mengering secara spontan di udara. Setelah kering, bahan dipasang ke lembaran dengan panas. Untuk melakukan ini, dengan bantuan pinset, lembaran dilewatkan 3 hingga 4 kali melalui nyala api pembakar Bunsen, berhati-hatilah agar bahan tidak terbakar.

Lembaran dibiarkan dingin dan ditempatkan di jembatan pewarnaan.

Tanaman padat

Untuk melakukan smear untuk pewarnaan Gram dari kultur padat, lakukan sebagai berikut:

Sebelum memilih koloni yang akan diambil, kaca objek harus disiapkan dengan menempatkan kira-kira dua tetes larutan garam fisiologis steril.

Jika cawan kultur asli berisi beberapa jenis koloni, masing-masing koloni terisolasi akan dipilih untuk melakukan Gram. Setiap koloni akan diambil dengan loop platinum untuk larut dalam larutan garam yang sebelumnya ditempatkan pada kaca objek.

Gerakan melingkar dibuat dari pusat menuju pinggiran, untuk mendistribusikan koloni secara homogen pada slide.

Biarkan mengering secara spontan di udara. Setelah kering, lembaran diperbaiki dengan panas, seperti dijelaskan sebelumnya (dengan menyalakan slide dengan korek api), berhati-hatilah agar tidak membakar bahan.

Prosedur ini harus dilakukan dengan setiap jenis koloni yang berbeda. Di selembar kertas perlu diperhatikan urutan apa yang diamati, misalnya:

Koloni 1: Koloni kuning beta-hemolitik: Kokus Gram positif diamati dalam kelompok

Koloni 2: Koloni berwarna krem, tanpa hemolisis: Terobservasi coccobacilli gram negatif.

Setiap slide harus diberi label untuk mengetahui apa yang kita amati.

Teknik

Teknik pewarnaan Gram sangat mudah dilakukan dan relatif murah serta tidak dapat dilewatkan di laboratorium mikrobiologi.

Itu dilakukan sebagai berikut:

1. Perbaiki noda dengan panas dan letakkan di jembatan pewarnaan.
2. Tutupi kaca objek sepenuhnya dengan kristal violet selama 1 menit.
3. Cuci bersih dengan air Jangan dikeringkan
4. Tutupi lembaran dengan larutan lugol, diamkan selama 1 menit. Cuci bersih dengan air Jangan dikeringkan.
5. Pemutih selama 5-10 detik dengan pengocokan lembut dalam alkohol aseton. Atau, letakkan lembaran dalam posisi vertikal dan teteskan penghilang warna ke permukaan sampai sisa kaca ungu yang tidak tertahan hilang. Tidak melebihi.
6. Cuci bersih dengan air Jangan dikeringkan.
7. Ganti slide pada jembatan pewarnaan dan tutup selama 30 detik dengan safranin (Gram-Hucker) atau 1 menit dengan fuchsin dasar (Gram-Kopeloff).
8. Cuci dengan air
9. Biarkan mengering secara spontan dalam posisi tegak.

Setelah kering, teteskan 1 tetes minyak imersi untuk mengamatinya di bawah sasaran 100X di mikroskop cahaya.

Utilitas

Teknik ini memungkinkan untuk membedakan perbedaan morfotintorial kebanyakan bakteri.

Ragi juga dibedakan dengan pewarnaan ini. Mereka mengambil kristal violet, yaitu, menodai Gram positif.

Di sisi lain, batang Gram-positif pembentuk spora dapat dibedakan, di mana terlihat ruang kosong di dalam basil, tempat endospora terbentuk, meskipun spora tidak ternoda dengan baik. Teknik lain seperti Shaeffer-Fulton digunakan untuk mewarnai spora.

Perlu dicatat bahwa pewarnaan ini tidak digunakan untuk mewarnai semua jenis bakteri, yaitu, ada kasus di mana pewarnaan tidak berfungsi.

Dalam hal ini bakteri yang kekurangan dinding sel dapat disebutkan. Misalnya: genus Mycoplasma, spheroplasts, ureaplasma, L-forms dan protoplasts.

Ini juga menodai bakteri yang sangat parah dengan dinding yang kaya asam mikolat, seperti Mycobacteria, dan bakteri intraseluler seperti Chlamydias dan Rickettsias.

Ini juga tidak efektif dalam menodai sebagian besar bakteri spirochetal.

Ada bakteri dari genus yang sama yang dapat diamati dalam sampel yang sama seperti Gram positif dan Gram negatif. Jika ini terjadi, ini disebut pewarnaan Gram variabel, yang dapat disebabkan oleh perubahan nutrisi, suhu, pH, atau konsentrasi elektrolit.

Kesalahan Umum

Pemutihan yang berlebihan

Langkah perubahan warna yang berlebihan dapat menyebabkan pengamatan mikroorganisme Gram negatif palsu.

Tidak menunggu waktu pengeringan yang cukup lama untuk menambahkan minyak imersi

Ini dapat menyebabkan bakteri Gram positif menodai Gram negatif (negatif Gram palsu). Hal ini terjadi karena dalam kultur lama ada kemungkinan bakteri mati atau rusak dan dalam kondisi ini bakteri tidak mempertahankan kristal violet.

Gunakan larutan lugol yang sangat tua:

Seiring waktu lugol kehilangan sifatnya dan warnanya memudar. Jika reagen yang sudah terdegenerasi digunakan, reagen tersebut tidak akan mengikat kristal violet dengan baik, oleh karena itu terdapat kemungkinan mendapatkan visualisasi mikroorganisme Gram negatif yang salah.

Latar belakang biru

Latar belakang yang berubah warna dengan benar akan berwarna merah. Latar belakang biru menunjukkan bahwa perubahan warna tidak mencukupi.

Referensi

1. Ryan KJ, Ray C. 2010. Sherris. Mikrobiologi Medis, edisi ke-6 McGraw-Hill, New York, AS
2. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnosis Mikrobiologis. (Edisi ke-5). Argentina, Editorial Panamericana SA
3. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. 2009. Diagnosis Mikrobiologi Bailey & Scott. 12 ed. Argentina. Editorial Panamericana SA
4. Casas-Rincón G. 1994. Mikologi Umum. Edisi ke-2 Universitas Pusat Venezuela, Edisi Perpustakaan. Venezuela Caracas.
5. "Noda Gram." Wikipedia, ensiklopedia gratis. 4 Okt 2018, 23:40 UTC. 9 Des 2018, 17:11. Diambil dari es.wikipedia.org.
6. González M, González N. 2011. Manual Mikrobiologi Medis. Edisi kedua, Venezuela: Direktorat Media dan Publikasi Universitas Carabobo.
7. López-Jácome L, Hernández-Durán M, Colín-Castro C, Ortega-Peña S, Cerón-González G, Franco-Cendejas F. Pewarnaan dasar di laboratorium mikrobiologi. Penelitian di Disabilitas. 2014; 3 (1): 10-18.