PEWARNAAN GIEMSA: DASAR PEMIKIRAN, BAHAN, TEKNIK DAN PENGGUNAAN - BIOLOGI - 2025

The Giemsa stain adalah jenis pewarnaan sampel klinis, berdasarkan campuran pewarna asam dan dasar. Penciptaannya terinspirasi oleh pekerjaan yang dilakukan oleh Romanowsky, di mana Gustav Giemsa, seorang ahli kimia dan bakteriologi yang berasal dari Jerman, menyempurnakannya dengan menambahkan gliserol untuk menstabilkan senyawanya.

Perubahan yang dihasilkan pada teknik Romanowsky asli memungkinkan untuk meningkatkan pengamatan mikroskopis secara signifikan, oleh karena itu teknik tersebut dibaptis dengan nama pewarnaan Giemsa.

Berbagai sampel diwarnai dengan pewarnaan Giemsa. A. Trypanosoma evansi dalam darah tepi. B. Sel darah normal. C. Borrelia theileri dalam darah tepi. D. Limfoma Burkitt.

Karena ini adalah teknik yang sederhana untuk dilakukan, sangat fungsional dan ekonomis, saat ini teknik ini banyak digunakan di laboratorium klinis untuk apusan hematologi, sampel sumsum tulang dan bagian jaringan.

Teknik pewarnaan Giemsa sangat berguna untuk studi sitologi, karena memungkinkan pengamatan struktur sel tertentu. Teknik ini menodai sitoplasma, nuklei, nukleolus, vakuola, dan butiran sel, bahkan mampu membedakan jejak kromatin yang halus.

Lebih jauh, perubahan signifikan dalam ukuran, bentuk atau warna inti dapat dideteksi, di mana dimungkinkan untuk memvisualisasikan hilangnya hubungan inti-sitoplasma.

Di sisi lain, ini memungkinkan untuk mengidentifikasi sel-sel yang belum matang di sumsum tulang dan darah perifer, yang penting untuk diagnosis penyakit serius seperti leukemia. Hal ini juga memungkinkan untuk mendeteksi hemoparasit, bakteri ekstra dan intraseluler, jamur, dan lain-lain.

Dalam sitogenetika itu banyak digunakan, karena dimungkinkan untuk mempelajari mitosis sel.

Dasar pewarnaan Giemsa

Pewarna tipe Romanowsky didasarkan pada penggunaan kontras antara pewarna asam dan basa, untuk mencapai pewarnaan struktur basa dan asam. Seperti yang dapat dilihat, ada afinitas zat warna asam untuk mewarnai struktur basa dan sebaliknya.

Pewarna dasar yang digunakan adalah biru metilen dan turunannya yang teroksidasi (Azure A dan Azure B), sedangkan pewarna asam adalah eosin.

Struktur asam sel adalah asam nukleat, antara lain butiran dari basofil tersegmentasi, oleh karena itu akan diwarnai dengan biru metilen.

Dalam pengertian yang sama, struktur dasar sel adalah hemoglobin dan beberapa butiran seperti yang terkandung dalam eosinofil tersegmentasi, antara lain; ini akan diwarnai dengan eosin.

Di sisi lain, karena fakta bahwa metilen biru dan biru biru dicirikan sebagai pewarna metakromatik, mereka dapat memberikan rona variabel pada struktur yang berbeda sesuai dengan beban polianion yang dimilikinya.

Beginilah cara kombinasi strategis pewarna basa dan asam berhasil mengembangkan spektrum warna yang luas, sesuai dengan karakteristik biokimia dari setiap struktur, berjalan melalui warna biru pucat, biru tua, ungu dan ungu dalam kasus struktur asam.

Sedangkan pewarnaan yang diberikan oleh eosin lebih stabil, menghasilkan warna antara oranye kemerahan dan salmon.

bahan

Bahan untuk menyiapkan larutan stok

Persiapan larutan stok membutuhkan penimbangan 600 mg bubuk pewarna Giemsa, takaran 500 ml metil alkohol bebas aseton dan 50 ml gliserin netral.

Bagaimana menyiapkan larutan stok

Tempatkan bubuk Giemsa yang kental di dalam lesung. Jika ada gumpalan sebaiknya disemprot. Kemudian tambahkan gliserin dalam jumlah yang cukup banyak dan aduk rata. Campuran yang diperoleh dituangkan ke dalam botol amber yang sangat bersih.

Sisa gliserin ditempatkan di mortar. Aduk lagi untuk membersihkan sisa pewarna yang menempel di dinding mortar dan tuangkan ke dalam stoples yang sama.

Botol ditutup dan ditempatkan dalam penangas air bersuhu 55ºC selama 2 jam. Saat berada dalam bak air, kocok perlahan campuran tersebut setiap setengah jam atau lebih.

Selanjutnya, campuran dibiarkan menjadi dingin untuk menempatkan alkohol. Sebelumnya, sebagian alkohol terukur ditempatkan di mortar untuk menyelesaikan pencucian pewarna yang tersisa dan kemudian ditambahkan ke campuran bersama dengan sisa alkohol.

Persiapan ini harus dibiarkan matang setidaknya selama 2 minggu. Porsi bekas larutan stok harus disaring.

Untuk menghindari kontaminasi pada sediaan, disarankan untuk memindahkan porsi yang akan terus digunakan ke botol amber kecil dengan pipet. Isi ulang setiap kali reagen habis.

Bahan untuk menyiapkan solusi Buffer

Di sisi lain, larutan buffer pada pH 7,2 dibuat sebagai berikut:

6,77 g natrium fosfat (anhidrat) (NaHPO ₄ ), 2,59 g kalium dihidrogen fosfat (KH ₂ PO ₄ ) dan air suling ditimbang hingga 1000 cc.

Persiapan akhir pewarna

Untuk persiapan larutan pewarnaan akhir, 2 ml larutan stok yang disaring diukur dan dicampur dengan 6 ml larutan buffer. Aduk campuran.

Fakta relevan yang harus diperhitungkan adalah bahwa teknik persiapan pewarnaan dapat berubah tergantung pada perusahaan komersial.

Bahan tambahan yang dibutuhkan untuk melakukan pewarnaan

Selain bahan yang dijelaskan, Anda harus memiliki jembatan pewarna, kaos dengan air atau penyangga untuk mencuci, slide atau penutup objek untuk benda, stopwatch untuk mengontrol waktu pewarnaan dan kertas blotting atau beberapa bahan yang dapat digunakan untuk mengeringkan ( kain kasa atau kapas).

Teknik

Proses pewarnaan

1) Sebelum pewarnaan, noda sampel harus siap pada slide yang bersih.

Sampel dapat berupa darah, sumsum tulang, bagian jaringan histologis atau sampel serviks-vagina. Dianjurkan agar olesan tipis dan dikeringkan selama 1 atau 2 jam sebelum diwarnai.

2) Pada jembatan pewarnaan, tempatkan semua lembaran yang harus diwarnai. Anda selalu bekerja dalam urutan yang sama dan setiap lembar teridentifikasi dengan baik.

3) Tempatkan beberapa tetes 100% metil alkohol (metanol) pada apusan dan biarkan bekerja selama 3 sampai 5 menit, untuk memperbaiki dan mengeringkan sampel.

4) Buang metanol yang ada di lembaran dan biarkan mengering.

5) Setelah kering, tempatkan larutan pewarna terakhir dengan pipet sampai seluruh lembaran tertutup. Biarkan bertindak selama 15 menit. Beberapa penulis merekomendasikan hingga 25 menit. Itu tergantung pada rumah bisnis.

6) Tiriskan noda dan cuci noda dengan air suling atau dengan larutan buffer 7,2.

7) Di atas kertas blotting, biarkan seprai mengering di udara terbuka, disusun secara vertikal dengan bantuan penopang.

8) Bersihkan bagian belakang slide dengan kapas alkohol atau kapas untuk menghilangkan jejak noda.

Keperluan

Teknik pewarnaan Giemsa digunakan di berbagai bidang, antara lain: hematologi, mikologi, bakteriologi, parasitologi, sitologi, dan sitogenetika.

Hematologi

Ini adalah penggunaan yang paling sering diberikan untuk noda ini. Dengannya, setiap sel yang ada di sumsum tulang atau sampel darah perifer dapat diidentifikasi. Serta memperkirakan jumlah tiap serinya, mampu mendeteksi leukositosis atau leukopenia, trombositopenia, dll.

Karena sensitif dalam mengidentifikasi sel imatur, maka relevan dalam diagnosis leukemia akut atau kronis. Dimungkinkan juga untuk membuat diagnosis anemia, seperti anemia sel sabit, sel sabit, dan lain-lain.

Ilmu jamur

Pada daerah ini sering digunakan untuk mencari Histoplasma capsulatum (jamur dimorfik intraseluler) pada sampel jaringan.

Bakteriologi

Pada apusan hematologi yang diwarnai dengan Giemsa, Borrelias sp dapat dideteksi pada pasien yang datang dengan penyakit yang disebut demam berulang. Spirochetes berlimpah di antara eritrosit, dalam sampel yang diambil pada puncak demam.

Juga dimungkinkan untuk memvisualisasikan bakteri intraseluler seperti Rickettsia sp dan Chlamydia trachomatis dalam sel yang terinfeksi.

parasitologi

Di bidang parasitologi, pewarnaan Giemsa memungkinkan untuk mendiagnosis penyakit parasit seperti malaria, penyakit Chagas dan leishmaniasis.

Pada dua parasit pertama, parasit Plasmodium sp dan Trypanosoma cruzi masing-masing dapat dilihat pada darah tepi pasien yang terinfeksi, dapat ditemukan pada stadium yang berbeda tergantung pada stadium penyakitnya.

Untuk meningkatkan pencarian parasit dalam darah, disarankan untuk menggunakan pewarnaan Giemsa yang dicampur dengan noda May-Grünwald.

Demikian juga, leishmaniasis kulit dapat didiagnosis dengan mengevaluasi sampel biopsi kulit bernoda Giemsa tempat parasit ditemukan.

Sitologi

Pewarnaan Giemsa juga digunakan untuk studi sitologi sampel endoserviks, meskipun ini bukan teknik yang paling sering digunakan untuk tujuan ini.

Tetapi dalam kasus kelangkaan sumber daya, ini dapat digunakan, memiliki fungsi yang mirip dengan yang ditawarkan oleh teknik Papanicolaou dan dengan biaya lebih rendah. Namun, hal itu membutuhkan keahlian dari pihak penguji.

Sitogenetika

Fitur pewarnaan Giemsa yang relevan adalah kemampuannya untuk mengikat dengan kuat ke daerah DNA yang kaya adenin dan timin. Hal ini memungkinkan DNA divisualisasikan selama mitosis sel, dalam kondisi kondensasi yang berbeda.

Studi ini diperlukan untuk mendeteksi penyimpangan berwarna seperti duplikasi, penghapusan, atau translokasi dari berbagai daerah kromosom.

Penelitian yang mendemonstrasikan khasiat pewarnaan Giemsa

Cannova et al (2016), membandingkan 3 teknik pewarnaan untuk diagnosis leishmaniasis kulit.

Untuk ini, mereka menggunakan sampel yang diperoleh dari hewan percobaan (Mesocrisetus auratus) yang diinokulasi secara eksperimental dengan Leishmanias.

Penulis menunjukkan bahwa pewarnaan Giemsa lebih baik daripada pewarnaan Pap-mart® dan Gaffney. Oleh karena itu, mereka menganggap pewarnaan Giemsa ideal untuk mendiagnosis leishmaniasis kulit.

Hasil luar biasa yang diperoleh oleh penulis disebabkan oleh fakta bahwa kombinasi pewarna yang membentuk campuran Giemsa menyajikan kondisi yang diperlukan untuk menciptakan kontras yang menguntungkan, memungkinkan struktur amastigote dibedakan dengan jelas, baik secara intraseluler maupun ekstraseluler.

Teknik lain (Pap-mart® dan Gaffney) juga melakukannya, tetapi dengan cara yang lebih lemah dan karena itu lebih sulit untuk divisualisasikan. Itulah mengapa pewarnaan Giemsa direkomendasikan untuk diagnosis parasitologis leishmaniasis.

Demikian juga, sebuah studi oleh Ramirez et al (1994) mengevaluasi validitas pewarnaan Giemsa dan Lendrum pada apusan konjungtiva untuk identifikasi Chlamydia trachomatis.

Penulis menentukan bahwa pewarnaan Giemsa dan Ledrum memiliki spesifisitas yang sama, tetapi Giemsa ternyata lebih sensitif.

Ini menjelaskan mengapa pewarnaan Giemsa saat ini paling sering digunakan untuk diagnosis infeksi klamidia, terutama jika sumber dayanya sedikit.

Sumber: Reagen PanReac Applichem ITW. Noda Giemsa. Versi 2: JMBJUL17 CEIVD10ES. Castellar del Vallés, Spanyol.

Rekomendasi untuk pewarnaan yang baik

Pengeringan lembaran sebaiknya tidak dipercepat. Waktu yang wajar harus diharapkan untuk mengeringkannya di udara terbuka. Kurang lebih 2 jam.

Warnai segera setelah 2 jam untuk hasil terbaik.

Agar noda menempel dan menodai dengan lebih baik, sampel harus didistribusikan pada slide sedemikian rupa sehingga lapisan tipis dan seragam tetap ada.

Sampel darah yang disukai adalah kapiler, karena apusan dibuat langsung dari tetesan darah dan oleh karena itu sampel tersebut tidak mengandung aditif, yang mendukung pemeliharaan struktur seluler.

Namun, jika darah vena digunakan, EDTA harus digunakan sebagai antikoagulan dan bukan heparin, karena heparin biasanya merusak sel.

Kesalahan umum dalam pewarnaan Giemsa

Dalam prakteknya kesalahan pewarnaan bisa dilakukan. Mereka dibuktikan dengan perubahan mendadak dalam tonalitas struktur.

Pewarnaan yang sangat biru

Mungkin karena:

• Noda yang sangat tebal
• Melebihi waktu pewarnaan
• Cuci tidak cukup.
• Penggunaan reagen jauh di atas pH netral (basa).

Dalam kondisi ini warna struktur berikut terdistorsi, sedemikian rupa sehingga eritrosit alih-alih menodai salmon-pink akan tampak hijau, butiran eosinofil yang harus diwarnai merah bata akan berubah menjadi kebiruan atau abu-abu dan seterusnya akan ada penyimpangan dengan nada biasa.

Pewarnaan yang sangat merah muda

Mungkin karena:

• Waktu pewarnaan tidak cukup.
• Pencucian yang terlalu lama atau berlebihan.
• Pengeringan yang buruk.
• Penggunaan reagen yang sangat asam.

Dalam kasus khusus ini, bangunan yang biasanya bernoda biru tidak akan terlihat, sedangkan bangunan yang bernoda merah muda akan memiliki rona yang berlebihan.

Contoh: Sel darah merah akan berubah menjadi merah cerah atau oranye terang, kromatin inti akan tampak merah muda pucat, dan butiran eosinofil akan menjadi merah terang.

Adanya endapan dalam noda

Penyebabnya bisa jadi:

• Gunakan film yang kotor atau tidak dicuci dengan baik.
• Jangan biarkan noda mengering dengan baik.
• Meninggalkan solusi perbaikan terlalu lama.
• Pencucian yang tidak memadai di akhir pewarnaan.
• Filtrasi tidak memadai atau tidak ada filtrasi pewarna yang digunakan.

Kehadiran artefak morfologi

Artefak morfologi mungkin muncul dalam noda yang membuat sulit untuk memvisualisasikan dan menafsirkan struktur yang ada. Ini berhubungan dengan:

• Jenis antikoagulan yang digunakan, seperti heparin.
• Penggunaan film yang kotor, rusak atau berminyak.

Mode penyimpanan

Setelah persiapan, pewarna harus disimpan pada suhu kamar (15-25 ° C), untuk mencegah pewarna mengendap. Ini harus disimpan dalam wadah kuning yang tertutup rapat.

Referensi

1. Cannova D, Brito E dan Simons M. Evaluasi teknik pewarnaan untuk diagnosis Leishmaniasis kulit. Salus. 2016; 20 (2): 24-29.
2. PanReac Applichem ITW Reagen. Noda Giemsa. Versi 2: JMBJUL17 CEIVD10ES. Castellar del Vallés, Spanyol.
3. Clark G. Prosedur pewarnaan (1981), 4th. Williams & Willkins.
4. Kimia Klinik Terapan. Pewarnaan Giemsa untuk diagnostik in vitro. Distributor: cromakit.es
5. Ramírez I, Mejía M, García de la Riva J, Hermes F dan Grazioso C. Validitas noda Giemsa dan Lendrum pada apusan konjungtiva untuk identifikasi Chlamydia trachomatis. Bol dari Sanit Panam. 1994; 116 (3): 212-216.
6. Casas-Rincón G.Mikologi Umum. 1994. Edisi ke-2 Universitas Pusat Venezuela, Edisi Perpustakaan. Venezuela Caracas.
7. "Noda Giemsa." Wikipedia, ensiklopedia gratis. 1 Sep 2017, 01:02 UTC. 6 Des 2018, es.wikipedia.org.