MEDIA LÖWENSTEIN-JENSEN: ALAS BEDAK, PERSIAPAN DAN PENGGUNAAN - BIOLOGI - 2025

The Lowenstein-Jensen media adalah medium padat selektif untuk isolasi dan perkembangan bakteri dari Mycobacterium genus, seperti Mycobacterium tuberculosis, M. avium, antara lain, dengan pengecualian dari spesies leprae, yang tidak culturable.

Bakteri dari genus Mycobacterium tidak tumbuh pada media kultur konvensional, oleh karena itu perlu dirancang suatu media khusus untuk isolasi. Media aslinya diciptakan oleh Löwenstein dan kemudian dimodifikasi oleh Jensen.

Medium Löwenstein-Jensen dengan koloni Mycobacterium tuberculosis. Sumber: Agarwal dkk / BioMed Central Ltd., dengan izin dari Biology Image Library

Modifikasi terdiri dari penghapusan pewarna merah Kongo, menggantikannya dengan konsentrasi perunggu hijau yang lebih tinggi. Ini juga mengubah konsentrasi magnesium sitrat dan monopotasium fosfat.

Medium Löwenstein-Jensen saat ini mengandung pati kentang, asparagine, magnesium sitrat, monopotassium fosfat, magnesium sulfat, malachite green, asam nalidixic, cycloheximide, lincomycin, telur kocok, gliserin, dan air.

Mikobakteri biasanya diisolasi dari tempat yang tidak steril, seperti dahak, urin, abses, dan lain-lain. Ini berarti bahwa sebagian besar sampel akan mengandung mikrobiota biasa di daerah tersebut, ditambah patogen.

Itulah mengapa medium Löwenstein-Jensen mengandung sederet inhibitor yang komposisinya diwakili oleh malachite green, antibiotik dan antijamur.

Selain itu, sampel yang berasal dari situs non-steril harus didekontaminasi dan dinetralkan sebelum disemai di media Löwenstein-Jensen.

Dasar

Kehadiran telur dan gliserin dalam medium Löwenstein-Jensen merangsang pertumbuhan mikobakteri karena menyediakan asam lemak dan protein yang diperlukan untuk perkembangan mikroorganisme tersebut.

Medium Löwenstein-Jensen mengandung malachite green, yang merupakan penghambat mikrobiota penyerta. Tetapi juga mengandung asam nalidixic (35 µg / mL), yang menghambat mikrobiota Gram negatif, sikloheksimida (400 µg / mL), yang menghambat jamur dan khamir saprofit, dan lincomycin (2 µ / mL), yang menghambat mikrobiota Gram positif.

Beberapa rumah komersial lebih suka menambahkan kombinasi antibiotik berikut: polimiksin B 200.000 unit / L, amfoterisin B 10 mg / L, karbenisilin 50 mg / L dan trimetoprim 10 mg / L.

Media ini tidak mengandung agar, oleh karena itu pemadatan media terjadi karena koagulasi albumin yang ada di dalam telur selama sterilisasi.

Persiapan

Timbang 37,3 g media dehidrasi dalam 600 ml air suling yang sebelumnya telah ditambahkan 12 ml gliserol. Campuran dipanaskan sambil diaduk sampai benar-benar larut. Autoklafkan media pada 121 ° C selama 15 menit.

Di sisi lain, suspensi homogen dari 1000 ml telur segar harus disiapkan dalam kondisi aseptik. Tambahkan suspensi telur ke dalam 600 ml media yang disiapkan pada suhu 50 - 60 ° C, hindari gelembung udara.

Larutan antibiotik juga ditambahkan setelah sterilisasi di dalam autoklaf.

Tuang media ke dalam tabung reaksi bertutup ulir yang steril. Panaskan tabung pada 85 ° C selama 45 menit dalam posisi miring.

Warna media yang disiapkan adalah hijau aquamarine dan dapat menimbulkan bintik-bintik keputihan karena adanya lemak telur.

PH media harus 7,2 ± 0,2

Simpan tabung di lemari es dan terlindung dari cahaya langsung sampai digunakan. Marah sebelum disemai.

Ada modifikasi dari media yang disebut "Modifikasi Gruft dari Löwenstein Jensen". Ini mengandung senyawa yang sama dengan media klasik tetapi RNA-5mg / 100 mL ditambahkan, dan sebagai inhibitor mengandung malachite hijau 0,025 g / 100 mL, penisilin 50 U / mL dan asam nalidixic 35 µg / mL.

Aplikasi

Medium Löwenstein-Jensen digunakan untuk isolasi mikobakteri dari berbagai jenis sampel. Pewarnaan Ziehl-Neelsen direkomendasikan untuk semua spesimen yang dicurigai adanya mikobakteri.

Beberapa sampel berasal dari tempat yang steril tetapi yang lainnya tidak. Sampel yang tidak steril harus didekontaminasi sebagaimana mestinya:

Dahak

Sampel dahak harus didekontaminasi sebagai berikut: tentukan jumlah sampel dahak dalam ml dan tambahkan jumlah yang sama dari 4% NaOH ke sampel dan inkubasi pada suhu 37 ° C.

Kocok campuran sesering mungkin dalam 30 menit. Selanjutnya sentrifugasi pada 3000 RPM selama 30 menit.

Buang supernatan di atas larutan disinfektan fenolik. Gunakan sedimen untuk disemai, tetapi pH harus dinetralkan terlebih dahulu.

Untuk menetralkan sedimen digunakan 5% H ₂ SO ₄ dengan adanya indikator merah fenol hingga mencapai pH netral yang menyebabkan warna salmon.

Lavase lambung, lavage bronkial, dan aspirasi bronkial

Dalam hal ini, sampel harus disentrifugasi pada 3000 RPM selama 30 menit. Supernatan dibuang dan pelet digunakan. Untuk mendekontaminasi sedimen, tambahkan 3 ml NaOH 4% dan aduk sesering mungkin pada suhu 37 ° C selama setengah jam.

Centrifuge lagi, supernatannya dibuang dan peletnya digunakan. Yang terakhir harus dinetralkan seperti yang dijelaskan dalam sampel sputum.

Air seni

Biarkan sampel mengendap di lemari es selama 24 jam. Pisahkan supernatan. Pellet yang tersisa harus disentrifugasi selama 30 menit pada 3000 RMP. Buang supernatan lagi dan susun kembali pelet dengan 3 ml larutan fisiologis steril.

Tambahkan 3 ml NaOH 4% dan lanjutkan ke dekontaminasi dan netralisasi seperti yang dijelaskan sebelumnya.

Cairan asites, cairan pleura, cairan serebrospinal

Dalam jenis sampel ini disentrifugasi dan supernatannya dibuang. Lakukan Gram pada sedimen atau amati langsung di bawah mikroskop; Jika bakteri tidak diamati, langkah dekontaminasi tidak diperlukan, begitu juga dengan langkah netralisasi.

Dalam hal ini sampel dapat disemai secara langsung dengan menggunakan sedimen. Jika ada bakteri, lanjutkan ke dekontaminasi dan netralisasi seperti dijelaskan di atas.

Biopsi

Untuk jenis sampel ini, 5 ml air suling harus ditambahkan ke mesin sentrifugasi nanti pada 1500 RPM selama 10 menit. Buang supernatan dan sentrifus ulang pelet pada 3500 RPM selama 30 menit. Gunakan sedimen untuk menabur media kultur.

Usap laring

Kapas harus ditempatkan dalam tabung steril yang berisi air suling bagian yang sama dan NaOH 4%. Usap harus ditekan ke dinding tabung sehingga sampel diencerkan dalam cairan. Sentrifugasi dan gunakan sedimen. Netralkan sedimen seperti yang telah dijelaskan.

Ditabur

Media Löwenstein-Jensen diinokulasi dengan menambahkan 0,5 ml sampel pada permukaan media. Putar tabung untuk mendistribusikan sampel ke seluruh media. Jangan gunakan gagang platina.

Tabung kedua yang berisi media Stonebrink dapat disemai untuk mengisolasi Mycobacterium bovis dan spesies lain yang tidak tumbuh pada media Löwenstein-Jensen.

Inkubasi

Tabung yang diinokulasi diinkubasi secara aerob pada suhu 37 ° C, dengan tutupnya agak longgar dan miring sekitar 5 ° serta terlindung dari cahaya. Lingkungan dapat diperkaya dengan 5–10% karbon dioksida. Periksa kultur dua kali seminggu sampai koloni muncul.

Saat sampel telah diserap, tutupnya dikencangkan. Waktu inkubasi maksimum adalah 8 minggu, jika setelah waktu tersebut tidak ada pertumbuhan, dilaporkan negatif.

QA

Strain berikut dapat digunakan sebagai kontrol kualitas:

Mycobacterium tuberculosis ATCC 27294, Mycobacterium kansasii ATCC 12478, Mycobacterium avium ATCC 19291, Mycobacterium bovis ATCC 19219, Mycobacterium fortuitum ATCC 6841, Escherichia coli ATCC 25922, Streptococcus pyogenes ATCCoccematus 320, ATC

Pertumbuhan yang sangat baik diharapkan untuk tiga spesies pertama tersebut, untuk M. fortuitum pertumbuhan harus baik, sedangkan untuk M. bovis diharapkan sedikit atau tidak ada pertumbuhan. Sedangkan spesies selain genus Mycobacterium harus dihambat sepenuhnya.

Batasan

Media yang disiapkan harus terlindung dari cahaya, paparan cahaya dalam waktu lama menyebabkan media berubah dari hijau menjadi biru, dalam hal ini media tidak dapat digunakan lagi. Ini karena hijau perunggu bersifat fotosensitif.

Media yang mengandung telur dapat dengan mudah terkontaminasi jika tidak ditangani secara aseptik. Ini dapat dilarutkan jika terkontaminasi dengan bakteri proteolitik.

Pembudidayaan dan penanganan bakteri dari genus Mycobacterium membutuhkan personel yang berkualifikasi, yang mengetahui langkah-langkah biosafety yang harus diikuti untuk menghindari kontaminasi atau kontaminasi pada orang lain.

HCl tidak boleh digunakan dalam langkah netralisasi karena pembentukan natrium klorida, yang dapat menjadi racun bagi basil Koch.

Sampel harus disimpan dalam lemari es dan terlindung dari cahaya saat tidak sedang diproses.

Referensi

1. Laboratorium Francisco Soria Melguizo. 2009. Media selektif Löwenstein-Jensen. Tersedia di: f-soria.es
2. Laboratorium Britannia. 2017. Media Löwenstein-Jensen. Tersedia di: britanialab.com.
3. Laboratorium Neogen. Medium Löwenstein-Jensen. Tersedia di: foodsafety.neogen.com.
4. "Medium Löwenstein-Jensen." Wikipedia, ensiklopedia gratis. 20 Nov 2018, 15:15 UTC. 24 Apr 2019 pada 18:34. wikipedia.org
5. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnosis Mikrobiologis. Edisi ke-5. Editorial Panamericana SA Argentina.
6. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Diagnosis Mikrobiologis Bailey & Scott. 12 ed. Editorial Panamericana SA Argentina.
7. Mac Faddin J. (2003). Tes biokimia untuk identifikasi bakteri yang penting secara klinis. Edisi ke-3. Editorial Panamericana. Buenos Aires. Argentina.