PEWARNAAN ZIEHL-NEELSEN: ALASAN, REAGEN, DAN TEKNIK - BIOLOGI - 2025

The Ziehl-Neelsen teknik pewarnaan untuk mengidentifikasi mikroorganisme asam alkohol tahan (ARA). Nama prosedur mikrobiologi ini mengacu pada penulisnya: ahli bakteri Franz Ziehl dan ahli patologi Friedrich Neelsen.

Teknik ini adalah jenis pewarnaan diferensial, yang menyiratkan penggunaan pewarna berbeda untuk menciptakan kontras antara struktur yang ingin Anda amati, bedakan, dan identifikasi nanti. Pewarnaan Ziehl-Neelsen digunakan untuk mengidentifikasi jenis mikroorganisme tertentu.

Pewarnaan Ziehl-Neelsen

Beberapa organisme ini adalah mikobakteri (mis., Mycobacterium tuberculosis), nocardia (mis., Nocardia sp.), Dan beberapa parasit uniseluler (mis., Cryptosporidium parvum). Banyak bakteri yang dapat diklasifikasikan melalui teknik umum yang disebut pewarnaan Gram.

Namun, beberapa kelompok bakteri memerlukan metode lain untuk dapat mengidentifikasinya. Teknik pewarnaan Ziehl-Neelsen membutuhkan kombinasi pewarna dengan panas untuk menempelkan pewarna ke dinding sel.

Kemudian muncul proses pemutihan yang memungkinkan dua hasil: resistensi atau kepekaan terhadap perubahan warna oleh asam dan alkohol.

Dasar

Dasar pemikiran teknik pewarnaan ini didasarkan pada sifat dinding sel mikroorganisme tersebut. Dindingnya terdiri dari sejenis asam lemak yang disebut asam mikolat; Ini dicirikan dengan memiliki rantai yang sangat panjang.

Ketika asam lemak memiliki struktur yang sangat panjang, asam lemak dapat menahan pewarna dengan lebih mudah. Beberapa genera bakteri sangat sulit diwarnai dengan pewarnaan Gram, karena kandungan asam mikolat yang tinggi di dinding sel.

Pewarnaan Ziehl-Neelsen menggunakan senyawa fenolik karbol fuchsin, pewarna dasar. Ini memiliki kemampuan untuk berinteraksi dengan asam lemak dari dinding sel, yang memiliki tekstur seperti lilin pada suhu kamar.

Pewarnaan karbol fuchsin ditingkatkan dengan adanya panas, karena lilin meleleh dan molekul pewarna bergerak lebih cepat ke dalam dinding sel.

Asam yang digunakan nantinya berfungsi untuk menghitamkan sel yang tidak ternoda karena dindingnya tidak cukup berhubungan dengan pewarna; oleh karena itu, kekuatan pemutih asam mampu menghilangkan zat warna asam. Sel yang menahan perubahan warna ini disebut tahan asam.

Pewarna sekunder

Setelah penghilangan warna sampel, itu dikontraskan dengan pewarna lain yang disebut pewarna sekunder. Umumnya, metilen biru atau hijau perunggu digunakan.

Pewarna sekunder menodai bahan latar belakang dan akibatnya menciptakan kontras pada struktur yang diwarnai pada langkah pertama. Hanya sel yang berubah warna yang menyerap pewarna kedua (counterstain) dan mengambil warnanya, sementara sel tahan asam mempertahankan warna merahnya.

Prosedur ini sering digunakan untuk identifikasi Mycobacterium tuberculosis dan Mycobacterium leprae, yang disebut basil tahan asam.

Reagen

Pewarna primer

0,3% carbol fuchsin (disaring) digunakan. Pewarna ini dibuat dari campuran alkohol: fenol dalam etanol (90%) atau metanol (95%), dan dalam campuran ini 3 gram fuchsin basa dilarutkan.

Solusi pemutihan

Pada langkah ini, larutan asam alkohol 3% atau asam sulfat 25% dapat digunakan.

Pewarna sekunder (counter-dye)

Pewarna yang paling sering digunakan untuk membedakan sampel biasanya 0,3% biru metilen. Namun, yang lain juga bisa digunakan, seperti 0,5% malachite green.

Teknik

Prosedur pewarnaan tahan asam

Siapkan apusan bakteri

Persiapan ini dilakukan pada slide yang bersih dan kering, mengikuti tindakan pencegahan sterilitas.

Pengeringan smear

Biarkan noda mengering pada suhu kamar.

Panaskan sampelnya

Sampel harus dipanaskan dengan mengoleskan api ke slide di bawah. Fiksasi alkohol dapat dilakukan jika apusan belum dibuat dengan sputum (diolah dengan natrium hipoklorit untuk memutihkannya) dan jika tidak segera meninggalkan noda.

M. tuberculosis dihilangkan dengan pemutih dan selama proses pewarnaan. Fiksasi panas pada sputum yang tidak diobati tidak akan membunuh M. tuberculosis, sedangkan fiksasi alkohol bersifat bakterisidal.

Tutupi noda

Noda ditutup dengan larutan carbol fuchsin (noda dasar primer).

Panaskan noda

Ini dilakukan selama 5 menit. Anda akan melihat evolusi uap (sekitar 60 ° C). Penting untuk tidak terlalu panas dan menghindari pembakaran sampel.

Berkenaan dengan memanaskan noda, kehati-hatian harus dilakukan saat memanaskan carbol fuchsin, terutama jika pewarnaan dilakukan di atas nampan atau wadah lain di mana bahan kimia yang sangat mudah terbakar dari pewarnaan sebelumnya telah dikumpulkan.

Hanya api kecil yang harus diaplikasikan di bawah slide menggunakan kapas yang menyala sebelumnya yang dibasahi dengan beberapa tetes alkohol asam, metanol atau etanol 70%. Hindari menggunakan kapas besar yang dibasahi etanol karena dapat menimbulkan bahaya kebakaran.

Cuci noda

Pencucian ini harus dilakukan dengan air bersih. Jika air keran tidak bersih, cuci noda dengan air yang disaring atau disuling, sebaiknya.

Tutupi noda dengan alkohol asam

Alkohol asam ini harus 3%. Penutupan dilakukan selama 5 menit atau sampai noda cukup berubah warna, yaitu merah muda pucat.

Harus diperhatikan bahwa alkohol yang bersifat asam mudah terbakar; oleh karena itu, harus digunakan dengan hati-hati. Hindari berada di dekat sumber penyulut.

Cuci noda

Pencucian harus dengan air suling bersih.

Tutupi noda dengan noda

Bisa berupa pewarnaan malachite green (0,5%) atau methylene blue (0,3%) selama 1 hingga 2 menit, menggunakan waktu yang lebih lama jika olesan tipis.

Cuci noda

Sekali lagi air bersih (suling) harus digunakan.

Menguras

Bagian belakang slide harus dibersihkan dan noda ditempatkan pada rak drainase agar mengering (jangan gunakan kertas penyerap untuk pengeringan).

Periksa noda di bawah mikroskop

Sasaran 100X dan minyak imersi harus digunakan. Pindai apusan secara sistematis dan catat pengamatan terkait.

Interpretasikan hasilnya

Secara teoritis, mikroorganisme dengan warna kemerahan dianggap positif tahan asam (AAR +).

Sebaliknya, jika mikroorganisme bernoda biru atau hijau, tergantung pada pewarna yang digunakan sebagai pewarna counter, mereka dianggap negatif tahan asam (AAR-).

Referensi

1. Apurba, S. & Sandhya, B. (2016). Essentials of Practical Microbiology (edisi ke-1st). Penerbit Medis Jaypee Brothers.
2. Bauman, R. (2014). Microbiology with Diseases by Body System (edisi ke-4th). Pearson Education, Inc.
3. Warisan, J., Evans, E. & Killington, A. (1996). Introductory Microbiology (edisi ke-1st). Cambridge University Press.
4. Morello, J., Granato, P. Wilson, M. & Morton, V. (2006). Manual Laboratorium dan Buku Kerja Mikrobiologi: Aplikasi untuk Perawatan Pasien (edisi ke-11). Pendidikan McGraw-Hill.
5. Vasanthakumari, R. (2007). Textbook of Microbiology (edisi ke-1st). Publikasi BI PVT.