TES KATALASE: DASAR PEMIKIRAN, TEKNIK DAN PENGGUNAAN - BIOLOGI - 2025

Uji katalase adalah suatu metodologi yang digunakan di laboratorium bakteriologi untuk mengungkap keberadaan enzim katalase pada bakteri yang memilikinya. Bersama dengan pewarnaan Gram, ini adalah tes utama yang harus dilakukan pada mikroorganisme yang baru diisolasi. Tes ini memandu ahli mikrobiologi pada langkah-langkah yang harus diikuti untuk identifikasi definitif dari mikroorganisme yang dimaksud.

Secara umum, bakteri yang mengandung sitokrom memiliki enzim katalase, yang berarti harus dimiliki oleh bakteri aerob dan anaerob fakultatif. Namun, ada pengecualian, seperti Streptococcus, yang meskipun merupakan mikroorganisme anaerob fakultatif, tidak memiliki enzim katalase.

Menjalankan Tes Katalase, menunjukkan reaksi positif. Sumber: Tidak ada penulis yang dapat dibaca mesin. Nase diasumsikan (berdasarkan klaim hak cipta).

Inilah sebabnya mengapa uji katalase digunakan terutama untuk membedakan keluarga Staphylococaceae dan Micrococaceae (keduanya katalase positif) dari keluarga Streptococaceae (katalase negatif).

Demikian juga, genus Bacillus (katalase positif), antara lain, dibedakan dari genus Clostridium (katalase negatif).

Dasar

Katalase adalah enzim yang tergolong hidroperoksidase, artinya mereka menggunakan hidrogen peroksida (H ₂ O ₂ ) sebagai substrat .

Ini juga dianggap oksidoreduktase, karena dalam reaksi di mana ia berpartisipasi terdapat unsur yang berfungsi sebagai donor elektron (zat pereduksi) dan lainnya sebagai reseptor elektron (zat pengoksidasi).

Katalase adalah protein yang mengandung gugus proserik dengan empat atom besi trivalen (Fe ⁺⁺⁺ ), oleh karena itu merupakan homoprotein. Ion besi tetap teroksidasi selama reaksi.

Dapat dikatakan bahwa katalase adalah enzim detoksifikasi, karena fungsinya untuk menghilangkan zat-zat yang diproduksi selama metabolisme bakteri yang bersifat toksik bagi bakteri. Di antara zat ini adalah hidrogen peroksida.

Hidrogen peroksida terbentuk dari pemecahan gula secara aerob. Proses ini terjadi sebagai berikut:

Ion superoksida (O ₂ ^- ) (radikal bebas) dibentuk sebagai produk akhir asimilasi glukosa melalui jalur aerobik. Ini beracun dan dihilangkan oleh enzim superoksida dismutase yang mengubahnya menjadi gas oksigen dan hidrogen peroksida.

Hidrogen peroksida juga beracun bagi bakteri dan harus dihilangkan. Katalase enzim memecah hidrogen peroksida menjadi air dan oksigen.

Katalase dapat bekerja pada substrat selain hidrogen peroksida, seperti alkohol, aldehida, asam, amina aromatik, dan fenol. Namun, hidrogen peroksida juga dapat digunakan oleh katalase untuk mengoksidasi senyawa beracun lainnya seperti metil dan etil alkohol.

Demikian juga, katalase hadir dalam sel fagositik, melindunginya dari aksi toksik hidrogen peroksida.

Teknik Rutin Tes Katalase

-Metode geser

bahan

3% hidrogen peroksida (10 volume).

Geser mikroskop

Gagang plastik sekali pakai atau tusuk gigi kayu.

Proses

Ambil cukup banyak koloni untuk dipelajari tanpa menyentuh agar-agar darimana asalnya. Koloni harus segar, yaitu dari budaya 18 hingga 24 jam.

Tempatkan koloni pada kaca objek kering dan tambahkan setetes hidrogen peroksida 3% ke dalamnya ( 30% H ₂ O ₂ juga dapat digunakan ). Amati segera apakah gelembung terlepas atau tidak.

Penafsiran

Reaksi positif: evolusi gas, dibuktikan dengan pembentukan gelembung (gelembung kuat).

Reaksi negatif: tidak ada pembentukan gelembung.

Metode -Direct dalam budaya murni

Tempatkan 1 ml 3% H ₂ O ₂ pada piring murni atau kultur irisan yang tidak mengandung darah (sebaiknya nutrient agar). Amati ada atau tidaknya langsung terbentuk gelembung. 30% H ₂ O ₂ juga bisa digunakan .

Itu ditafsirkan sama dengan metode objek porta.

-Metode dengan tabung kapiler atau Fung dan Petrishko

Isi tabung kapiler 67 mm hingga ketinggian 20 mm dengan hidrogen peroksida 3% secara kapilaritas.

Sentuh koloni yang diisolasi untuk dipelajari dengan kapiler yang diisi dengan 3% H ₂ O _{2 .} Amati apakah kapiler terisi gelembung dalam waktu kurang lebih 10 detik. Metode ini memungkinkan semi-kuantifikasi reaksi dalam persilangan:

Tanpa persilangan tidak ada gelembung (reaksi negatif).

+ ---- Beberapa gelembung (reaksi lemah atau tertunda).

++ --– Gelembung yang melimpah (reaksi sedang).

+++ --Bubbles mencapai ujung yang berlawanan (reaksi kuat).

-Taylor dan metode Achanzar untuk tes katalase yang memberikan dipertanyakan

Tempatkan koloni yang terisolasi pada slide yang bersih dan kering, kemudian setetes 0,5% H ₂ O ₂ dan tutup dengan penutup. Amati ada tidaknya pembentukan gelembung yang terperangkap.

Interpretasi: adanya gelembung menunjukkan reaksi positif. Tidak ada gelembung, itu diartikan sebagai reaksi negatif.

Uji katalase untuk spesies Mycobacterium

Teknik ini perlu dilakukan dengan mengatur pH dan suhu. Ini harus dilakukan di bawah tudung aliran laminar, karena manipulasi spesies Mycobacterium yang berbeda berbahaya.

-Bahan

Hidrogen peroksida 30% atau 110 volume (superoxal).

Buffer fosfat pH 7

10% Tween 80

Kultur irisan Mycobacterium selama 3 sampai 4 minggu

-Persiapan

Buffer fosfat pH 7

Menimbang:

1.361 g monopotassium fosfat anhidrat (KH ₂ PO ₄ ).

1.420 g disodium anhidrat (Na2HPO3) fosfat.

Larutkan kedua garam dalam sedikit air suling steril dan buat hingga 1000 ml dengan air.

10% Tween 80

Buat pengenceran 1:10 ke Tween 80 yang terkonsentrasi secara komersial, untuk melakukan ini, lanjutkan sebagai berikut:

Ambil 1 ml Tween 80 dan masukkan ke dalam sedikit air suling, larutkan lalu ubah volumenya dengan air menjadi 10 ml.

Reagen akhir

Campurkan sejumlah buffer fosfat dengan kuantitas 10% Tween 80 (bagian yang sama). Tentukan di laboratorium seberapa banyak yang ingin Anda persiapkan.

-Proses

Tempatkan 5 ml buffer fosfat dalam tabung reaksi bertutup ulir (Bakelite) yang steril.

Dengan loop inokulasi, ambil koloni yang cukup dari pertumbuhan Mycobacterium yang diunggulkan dalam irisan dan larut dalam buffer fosfat.

Tutup tabung tanpa terlalu mengencangkan utas. Tempatkan di bak air pada suhu 68 ° C selama 20 hingga 30 menit. Keluarkan dan dinginkan hingga 22-25 ° C

Takar 0,5 ml reagen akhir (campur) dan tambahkan ke tabung dengan larutan dingin. Amati pembentukan gelembung atau tidak.

Ini ditafsirkan sama dengan teknik sebelumnya.

Menggunakan

Ketika pertumbuhan koloni diperoleh dalam media yang diperkaya, pewarnaan Gram dan uji katalase harus dilakukan pada koloni yang diperoleh. Ini akan memandu ahli mikrobiologi tentang prosedur yang harus diikuti untuk identifikasi definitif.

Sumber: Disiapkan oleh penulis MSc. Marielsa gil

QA

Untuk mengevaluasi kinerja yang baik dari reagen hidrogen peroksida, gunakan strain kontrol yang baru dibudidayakan, seperti Staphylococcus aureus sebagai kontrol positif dan strain Streptococcus sp sebagai kontrol negatif.

Alternatif lain yang berfungsi sebagai kontrol positif adalah dengan meletakkan setetes hidrogen peroksida pada agar darah, eritrosit memiliki katalase, oleh karena itu akan terjadi gelembung-gelembung udara jika reagen dalam keadaan baik.

Agar coklat dapat digunakan sebagai kontrol negatif, di sini eritrositnya sudah terlarut dan tesnya negatif.

Batasan

-Jangan menggunakan kultur lama untuk pengujian, karena dapat menyebabkan negatif palsu.

-Jangan mengambil koloni dari biakan pada agar darah, jika Anda berhati-hati untuk tidak menyentuh agar; Prosedur ini dapat menyebabkan hasil positif palsu, karena sel darah merah mengandung katalase.

-Jika Anda mengambil koloni dengan gagang platina, jangan membalik urutan prosedur karena dapat menghasilkan positif palsu. Ini karena platina mampu bereaksi dengan hidrogen peroksida, menyebabkan gelembung.

-Jangan menggunakan reagen hidrogen peroksida jika sudah sangat tua, karena reagen sangat tidak stabil dan cenderung terurai seiring waktu.

-Jaga agar pereaksi hidrogen peroksida terlindung dari cahaya dan didinginkan untuk mencegah kerusakan.

-Lakukan kontrol kualitas reagen hidrogen peroksida setiap kali digunakan.

-Perhatikan bahwa jika 30% H ₂ O ₂ digunakan, reaksinya lebih kuat daripada yang dilakukan dengan 3% H ₂ O ₂ .

Referensi

1. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnosis Mikrobiologis. Edisi ke-5. Editorial Panamericana SA Argentina.
2. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Diagnosis Mikrobiologis Bailey & Scott. 12 ed. Editorial Panamericana SA Argentina.
3. Mac Faddin J. (2003). Tes biokimia untuk identifikasi bakteri yang penting secara klinis. Edisi ke-3. Editorial Panamericana. Buenos Aires. Argentina.
4. Laboratorium BD. Pereaksi Catalase-Gotario. Tersedia di: http://winklerltda.cl
5. Laboratorium Vadequímica. Peroksida. Kesetaraan antara volume dan persentase. Tersedia di: vadequimica.com