PROTEINASE K: KARAKTERISTIK, AKTIVITAS ENZIMATIK, APLIKASI - BIOLOGI - 2025

The K proteinase adalah enzim milik kelompok protease serin, yaitu, memiliki dalam tengahnya aktif secara katalitik serin asam amino dan memiliki fungsi melanggar ikatan peptida dengan hidrolisis. Selanjutnya, enzim ini termasuk dalam keluarga protein subtilisin (peptidase S8).

Proteinase K memiliki berat molekul (MW) sebesar 28.900 dalton dan pertama kali diisolasi pada tahun 1974 dalam ekstrak jamur album Engyodontium yang sebelumnya dikenal dengan nama Tritirachium album Limber.

Struktur molekul Proteinase K. Sumber: Lykchiniadis

Ia memiliki kapasitas proteolitik yang tinggi, ditunjukkan dengan mampu mendegradasi keratin yang ada di rambut. Kata keratin dalam bahasa Inggris dieja "keratin", oleh karena itu disebut "proteinase K".

Karena kemampuannya yang tinggi untuk membelah protein asli, enzim ini berguna dalam berbagai teknik biologi molekuler. Ini terutama digunakan untuk mengisolasi dan menyiapkan asam nukleat dengan berat molekul tinggi (MW).

Proteinase K bekerja dengan melepaskan DNA inti, sambil menghancurkan protein dan menonaktifkan RNase dan DNase, yaitu menghilangkan nuklease dalam sediaan DNA dan RNA.

Di sisi lain, telah terlihat bahwa proteinase K dapat menghidrolisis beberapa protein asli yang terdenaturasi, yang telah membangkitkan minat para peneliti untuk penggunaannya dalam studi protein prion (PrPC).

Namun, meskipun potensi proteolitiknya tinggi, terdapat protein yang resisten terhadap aksi proteinase K. Diantaranya adalah beberapa protein abnormal yang disebut prion (PrPSc), terkait dengan ensefalopati spongiform menular.

Karakteristik proteinase K.

Proteinase K memiliki struktur tersier yang terdiri dari tiga lapisan, dengan lembaran β tujuh rantai yang ditempatkan di antara dua lapisan heliks. Karena itu milik keluarga peptidase S8, itu ditandai dengan memiliki triad katalitik di situs aktifnya, yang urutannya berurutan (Asp, His dan Ser), yang membedakan mereka dari keluarga peptida lainnya.

Enzim dari kelompok serin protease ini dicirikan dengan menghidrolisis ikatan peptida yang dekat dengan gugus karboksilat asam amino alifatik dan aromatik.

Di sisi lain, ia mampu bertindak dengan adanya zat korosif tertentu, seperti natrium dodesil sulfat (SDS), Tris-HCL dan EDTA, yang digunakan untuk membantu denaturasi protein, menyebabkan mereka kehilangan struktur aslinya.

Ini adalah langkah awal dalam mempersiapkan protein untuk teknik elektroforesis. Kisaran pH di mana proteinase K bekerja cukup lebar (2,0 hingga 12,0), dengan pH optimal antara 7,5 hingga 12,0, dan titik isoelektriknya adalah 8,9. Seperti dapat dilihat, ini aktif pada kisaran pH yang sangat luas.

Karakteristik lain yang menonjol pada proteinase K adalah kestabilannya pada suhu tinggi (50 - 60 ° C).

Aktivitas enzimatik

Proteinase K membutuhkan keberadaan ion kalsium, meskipun hal ini tidak mempengaruhi aktivitasnya, jika penting untuk menjaga stabilitasnya.

Agar proteinase K mencerna substrat sepenuhnya, diperlukan waktu kontak sekitar 5 menit hingga 2 jam.

Namun, dalam pengertian ini, Daza dkk. Membandingkan kemurnian DNA yang diperoleh pada berbagai waktu pemaparan terhadap proteinase K, dan menyimpulkan bahwa inkubasi yang berkepanjangan (hingga 24 jam) secara signifikan meningkatkan kualitas DNA.

Namun terkait dengan konsentrasi enzim proteinase K yang digunakan pada protokol yang berbeda dapat dikatakan sangat bervariasi.

Ini dapat digunakan dari konsentrasi yang sangat rendah (5 µg / ml) hingga konsentrasi 500 µg / ml. Tetapi konsentrasi kerja yang paling umum berkisar antara 50–100μg / ml, terutama untuk pencernaan protein dan inaktivasi nuklease. Meskipun untuk pengobatan jaringan diperlukan konsentrasi 2 mg / ml.

Aplikasi

Aplikasinya sangat luas dan dapat diringkas sebagai berikut:

-Ini digunakan dalam pencernaan protein dan ekstraksi DNA dengan berbagai metode seperti: salting-out, PK-SDS, cetyl-trimethyl ammonium bromide (CTAB), kalium asetat yang dimodifikasi dan ekstraksi dengan natrium iodida.

-Inaktivasi nuklease (RNase dan DNase).

-Dalam teknik hibridisasi in situ (HIS), untuk membantu pelepasan asam nukleat, selain menghilangkan protein yang tidak diinginkan.

-Modifikasi protein.

-Di tingkat penelitian, dalam berbagai penelitian.

Keuntungan proteinase K

Beberapa studi banding telah dilakukan antara teknik ekstraksi DNA yang menggunakan Proteinase K, dengan teknik lain yang tidak menggunakannya dan semuanya menyimpulkan bahwa terdapat manfaat yang lebih besar jika menggunakan enzim. Keuntungannya meliputi:

-DNA dengan berat molekul tinggi, berkualitas tinggi dan kemurnian diperoleh.

-DNA yang diekstraksi stabil hingga 3 bulan.

DNA yang diekstraksi dapat digunakan dengan teknik berikut: Southern blot, polymerase chain reaction (PCR), elektroforesis, dan lain-lain.

Protein tahan proteinase K.

Berbagai investigasi telah menyimpulkan bahwa prion (protein PrPSc toksik abnormal) berbeda dari protein PrPC (asli) karena resisten terhadap aksi proteinase K, sedangkan PrPCs sensitif terhadap aksinya.

Penulis lain telah menjelaskan bahwa dalam struktur PrPSc terdapat bagian yang sensitif dan yang lainnya resisten terhadap proteinase K. Namun, kedua bagian tersebut sama-sama beracun dan menular.

Di sisi lain, Bastian dkk. Pada tahun 1987 mengisolasi 4 protein 28, 30, 66 dan 76 kda dari spesies Spiroplasma mirum. Semua ditemukan resisten terhadap aksi proteinase K dan juga memiliki reaksi silang dengan beberapa prion.

Diketahui bahwa spesies ini dapat menyebabkan katarak dan kerusakan neurologis yang penting dan karena temuan ilmiah Bastian, di antara penyelidikan lainnya, upaya telah dilakukan untuk menghubungkan mikroorganisme ini dengan ensefalopati spongiform menular.

Namun, etiologi dari patologi neurologis degeneratif ini terus dikaitkan dengan prion hari ini.

Dalam pengertian ini, Butler dkk. Pada tahun 1991 mengidentifikasi dan mengkarakterisasi kelas protein yang resisten terhadap proteinase K sebesar 40 kda dari dua strain Mycoplasma hyorhinis. Patogen ini mempengaruhi babi, menginfeksi jaringannya, tetapi dalam kasus ini tidak ada reaksi silang dengan prion yang diuji.

Lebih banyak penelitian diperlukan untuk menjelaskan banyak hal yang tidak diketahui dalam hal ini.

Referensi

1. Bastian F, Jennings R, dan Gardner W. 1987. Antiserum terhadap protein fibril terkait scrapie bereaksi silang dengan protein fibril Spiroplasma miru m. J. Clin. Mikrobiol. 25: 2430-2431.
2. Daza C, Guillen J, Rey J, Ruiz V. Evaluasi metode ekstraksi dan pemurnian DNA dari jaringan otot terfiksasi formaldehida dari mayat tak dikenal. Majalah Med, 2014; 22 (1): 42-49,
3. Butler G, Kotani H, Kong L, Frick M, Evancho S, Stanbridge E, dan Mcgarrity G. Identifikasi dan Karakterisasi Proteinase K-Resistant Proteins pada Anggota Kelas Molicutes. Infeksi dan Imunitas, 1991, 59 (3): 1037-1042
4. López M, Rivera M, Viettri M, Lares M, Morocoima A, Herrera L, dkk. Perbandingan dua protokol ekstraksi DNA Trypanosoma cruzi yang ditanam dalam media aksenik. Rev. Peru. Med. Exp. Kesehatan Masyarakat 2014; 31 (2): 222-227. Tersedia di: scielo.org
5. Jiménez G, Villalobos M, Jiménez E dan Palma W. Penentuan efektivitas lima protokol ekstraksi DNA dari bahan parafin untuk studi molekuler. Rev Méd Univ Costa Rica. 2007; 1 (1): 10-19.