IMMUNOFLUORESCENCE: DASAR PEMIKIRAN, PROTOKOL, DAN APLIKASI - BIOLOGI - 2025

The imunofluoresensi adalah teknik yang kuat immunostaining menggunakan antibodi terikat secara kovalen dengan molekul neon untuk mengidentifikasi target spesifik dalam sampel sel tetap ke sebuah dukungan yang solid.

Teknik ini melibatkan pengamatan mikroskopis dengan kekhususan imunologi, sehingga memungkinkan untuk mengamati sel hidup atau mati yang dapat menunjukkan jumlah antigen yang sangat kecil. Ini banyak digunakan baik di bidang penelitian dan dalam diagnosis klinis berbagai patologi.

Imunolabeling filamen aktin dalam sel kardiomiosit (Sumber: Ps1415 via Wikimedia Commons)

Teknik ini, terutama kualitatif (dengan beberapa varian kuantitatif), berkaitan secara khusus dengan visualisasi sampel dengan sinyal produk fluorofor, yang merupakan molekul fluoresen yang terikat pada antibodi dan yang mampu dieksitasi pada panjang gelombang tertentu. .

Dalam konteks seluler, sangat berguna untuk mempelajari ada / tidaknya protein dan lokasi subseluler. Teknik ini awalnya digunakan dalam pengaturan klinis untuk diagnosis virus seperti influenza dan selanjutnya untuk banyak penyakit menular lainnya.

Ini adalah teknik yang sangat sensitif, dan dengan peralatan mikroskop yang sesuai, dapat memiliki resolusi yang sangat baik. Untuk pengamatannya, diperlukan penggunaan mikroskop confocal atau epifluorescence.

Namun, meskipun sangat populer, ini dapat menimbulkan beberapa masalah penting sehubungan dengan memperoleh fluoresensi non-spesifik yang menghasilkan beberapa "kebisingan" latar belakang, yang seringkali membatasi pembacaan hasil yang memadai.

Dasar

Imunofluoresensi didasarkan pada eksploitasi fenomena biologis dari reaksi interaksi antara antibodi dan antigen. Ini berkaitan secara khusus dengan visualisasi atau deteksi reaksi ini dengan menarik molekul fluoresen ke panjang gelombang tertentu.

Antibodi adalah protein imunoglobulin yang disekresikan dari sel B aktif, yang secara khusus dihasilkan untuk melawan antigen, yang dapat diikat dengan afinitas dan spesifisitas yang tinggi. Imunofluoresensi memanfaatkan IgG imunoglobulin, yang ditemukan larut dalam serum darah.

Antibodi adalah molekul hingga 950 kDa yang terdiri dari dua rantai peptida pendek (ringan) dan dua panjang berbentuk "Y" (berat). Baik rantai ringan dan berat dibagi menjadi dua domain: satu variabel, mampu mengenali antigen, dan yang lainnya konstan atau kekal, karakteristik dari setiap spesies.

Antigen secara fungsional didefinisikan sebagai molekul yang dapat dikenali oleh antibodi dan sebagian besar merupakan protein. Ketika hewan terpapar antigen, limfosit sistem kekebalan diaktifkan, menghasilkan antibodi spesifik untuk melawannya dan berfungsi sebagai sistem pertahanan.

Antigen, seperti protein, misalnya, mungkin memiliki lebih dari satu epitop atau tempat yang dikenali oleh antibodi, sehingga serum hewan yang terpapar antigen mungkin memiliki antibodi poliklonal terhadap berbagai daerah protein yang sama.

Imunofluoresensi, kemudian, memanfaatkan kemampuan hewan untuk menghasilkan antibodi poliklonal melawan antigen tertentu untuk memurnikannya dan kemudian menggunakannya untuk mendeteksi antigen yang sama dalam konteks lain.

Di antara pewarna atau molekul fluoresen yang paling banyak digunakan untuk beberapa teknik imunofluoresensi adalah fluorescein isothiocyanate (FITC), tetramethylrhodamine isothiocyanate-5 dan 6 (TRITC), banyak sianin seperti Cy2, Cy3, Cy5 dan Cy7 dan pewarna yang disebut Alexa Fluor® , seperti Alexa Fluor®448.

Protokol

Protokol imunofluoresensi bervariasi tergantung pada banyak faktor, namun, secara umum, ini mencakup urutan langkah-langkah linier yang terdiri dari:

• Persiapan pelat dan sel
• Fiksasi sampel
• Permeabilisasi
• Pemblokiran
• Immunostaining atau imunostaining
• Perakitan dan observasi

-Persiapan

Dari sampel

Persiapan sampel akan tergantung pada sifatnya dan jenis pengalaman yang akan dilakukan. Kasus paling sederhana, yang melibatkan penggunaan sel dalam suspensi, akan dijelaskan di bawah ini.

Sel dalam suspensi, yaitu dalam media kultur cair, pertama-tama harus dipisahkan darinya dengan sentrifugasi dan kemudian harus dicuci dengan larutan penyangga atau "penyangga" isosmotik, yang menjaga integritasnya.

Biasanya, buffer fosfat-garam yang dikenal sebagai PBS digunakan, di mana sel disuspensi kembali dan campuran ini disentrifugasi lagi untuk mendapatkan sel bebas dari media kultur, yang mungkin mengandung zat yang mengganggu.

Dari bilahnya

Slide yang digunakan untuk pengamatan mikroskopis, di mana sel-selnya nantinya akan diperbaiki untuk perawatan hilir yang sesuai, juga harus disiapkan dengan hati-hati.

Ini ditutupi atau "peka" dengan larutan poli-lisin, polimer sintetis yang akan bertindak sebagai "perekat molekuler" antara sel dan penyangga padat, berkat interaksi elektrostatis antara muatan positif gugus amino mereka dan muatan negatif pada protein yang melapisi sel.

Fiksasi sampel

Proses ini terdiri dari imobilisasi protein yang ditemukan di dalam sel untuk menjaga lokasi spasial mereka tetap utuh. Molekul yang digunakan harus mampu melintasi semua jenis membran sel dan membentuk kisi dengan protein kovalen.

Formaldehida dan paraformaldehida, glutaraldehida dan bahkan metanol banyak digunakan, dimana sampel sel diinkubasi untuk waktu tertentu dan kemudian dicuci dengan larutan buffer isosmotik.

Setelah memperbaiki sel, sel tersebut terus ditempelkan pada lembaran yang sebelumnya telah disensitisasi dengan poli-lisin.

Permeabilisasi

Bergantung pada jenis pengujian yang dilakukan, perlu untuk meresapi sel yang diteliti atau tidak. Jika yang dicari adalah mengetahui letak, ada atau tidaknya suatu protein tertentu pada permukaan sel, maka permeabilisasi tidak diperlukan.

Sebaliknya, jika Anda ingin mengetahui lokasi protein di dalam sel, permeabilisasi sangat penting dan akan terdiri dari inkubasi sampel dengan Triton X-100, deterjen yang mampu menembus membran sel.

Pemblokiran

Langkah mendasar dalam semua teknik imunologi adalah memblokir. Pada tahap prosedur ini, pemblokiran terdiri dari penutup, pada lembaran peka, semua situs dengan molekul poli-lisin yang tidak dilekatkan sel. Artinya, mencegah penyatuan nonspesifik.

Biasanya untuk larutan pemblokiran digunakan bovine serum albumin (BSA) dalam buffer PBS dan hasil terbaik diperoleh dengan semakin lama waktu inkubasi dengan larutan ini. Setelah setiap langkah, termasuk pemblokiran, perlu untuk mencuci larutan yang tersisa.

Immunostaining atau imunostaining

Prosedur imunostaining atau imunostaining akan bergantung terutama pada apakah itu imunofluoresensi langsung atau tidak langsung (lihat di bawah).

Jika itu merupakan imunofluoresensi primer atau langsung, sampel akan diinkubasi dengan antibodi yang diinginkan, yang harus digabungkan dengan pewarna fluoresen. Prosedur inkubasi terdiri dari pengenceran antibodi dalam larutan yang juga mengandung BSA tetapi dalam proporsi yang lebih rendah.

Jika kasusnya adalah imunofluoresensi sekunder atau tidak langsung, dua inkubasi berturut-turut harus dilakukan. Pertama dengan antibodi yang diinginkan dan kemudian dengan antibodi yang mampu mendeteksi daerah konstan dari imunoglobulin primer. Antibodi sekunder inilah yang terikat secara kovalen ke fluorofor.

Teknik ini sangat serbaguna, memungkinkan pelabelan simultan lebih dari satu antigen per sampel, selama ada antibodi primer yang digabungkan dengan fluorofor yang berbeda, dalam kasus imunofluoresensi langsung.

Untuk pelabelan simultan pada imunofluoresensi tidak langsung, penting untuk memastikan bahwa setiap antibodi primer diproduksi pada hewan yang berbeda, serta setiap antibodi sekunder digabungkan dengan fluorofor yang berbeda.

Seperti pemblokiran, inkubasi dengan antibodi memberikan hasil yang lebih baik dengan waktu yang lebih lama. Setelah setiap langkah, perlu untuk membersihkan kelebihan antibodi yang tidak terikat pada sampel dan pada imunofluoresensi sekunder perlu diblok sebelum menambahkan antibodi sekunder.

Teknik tertentu menggunakan pewarnaan lain yang tidak terkait dengan pewarnaan imun, seperti pewarnaan DNA inti dengan fluorofor DAPI.

Perakitan dan observasi

Selama waktu inkubasi terakhir dengan fluorofor, sampel harus tetap berada dalam gelap. Untuk pengamatan di bawah mikroskop, adalah umum untuk menggunakan beberapa zat untuk mengawetkan fluoresensi dari fluorofor yang digabungkan dengan antibodi.

Jenis

Ringkasan grafis imunofluoresensi langsung dan tidak langsung (Sumber: Westhayl618 via Wikimedia Commons)

Imunofluoresensi langsung atau primer

Ini ada hubungannya dengan deteksi antigen melalui penggunaan antibodi fluoresen. Keuntungan utama menggunakan teknik ini adalah kecepatannya, namun, banyak kasus pengikatan nonspesifik dapat terjadi dalam prosesnya, terutama saat mempelajari serum manusia, karena kaya akan antibodi yang sangat heterogen.

Imunofluoresensi tidak langsung atau sekunder

Ini juga dikenal sebagai teknik "sandwich" dan ini melibatkan pengembangan teknik dalam dua langkah. Yang pertama berkaitan dengan penggunaan antibodi non-fluoresen dan pengikatannya ke antigen yang diinginkan.

Terhadap daerah konstan dari antibodi pertama ini (yang sekarang akan berfungsi sebagai antigen), antibodi kedua yang mampu mengenalinya digunakan, yang berhubungan dengan molekul fluoresen.

Munculnya sinyal fluoresen merupakan hasil dari pengenalan spesifik antara antibodi non-fluoresen pertama dan antigen yang diinginkan; keberadaan antibodi pertama ini mengkondisikan antibodi kedua, yang diberi label dan berkat itu ada atau tidaknya antigen dapat ditentukan.

Meskipun merupakan teknik yang jauh lebih memakan waktu daripada imunofluoresensi langsung (karena ini mencakup satu langkah inkubasi lagi), teknik ini tidak melibatkan desain antibodi fluoresen untuk setiap antigen yang dipelajari, yang menghasilkan, dalam istilah ekonomi, lebih layak.

Selain itu, ini adalah teknik yang lebih sensitif dalam hal penguatan sinyal, karena lebih dari satu antibodi sekunder dapat mengikat wilayah konstan dari antibodi primer, sehingga memperkuat intensitas sinyal fluoresen.

Aplikasi

Seperti yang telah disebutkan sebelumnya, imunofluoresensi adalah teknik yang sangat serbaguna, yang telah digunakan dalam banyak hal di bidang ilmiah dan klinis. Ini dapat digunakan untuk menjawab pertanyaan ekologi, genetik, dan fisiologis tentang banyak organisme.

Di antara aplikasi klinis, ini digunakan untuk diagnosis langsung beberapa penyakit dermatologis, baik menggunakan imunofluoresensi langsung atau tidak langsung pada jaringan epitel pasien yang diteliti.

Teknik imunofluoresensi telah tersedia dalam organisme uniseluler seperti ragi untuk memvisualisasikan mikrotubulus intranuklear dan sitoplasma, aktin dan protein terkait, filamen 10nm, dan konstituen lain dari sitoplasma, membran, dan dinding sel.

Referensi

1. Abcam, imunositokimia dan protokol imunofluoresensi. Diperoleh dari abcam.com
2. Greph, C. (2012). Pewarna Fluoresen. Diperoleh dari leica-microsystems.com
3. Miller, DM, & Shakest, DC (1995). Mikroskopi Imunofluoresensi. Dalam Metode dalam Biologi Sel (Vol. 48, hlm. 365-394). Academic Press, Inc.
4. Odell, ID, & Cook, D. (2013). Teknik Imunofluoresensi. Jurnal Dermatologi Investigatif, 133, 1-4.
5. Princle, BJR, Adams, AEM, Druain, DG, & Brian, K. (1991). Metode imunofluoresensi untuk ragi. Dalam Metode Enzimologi (Vol. 194, hlm. 565–602). Academic Press, Inc.
6. Schaeffer, M., Orsi, E. V, & Widelock, D. (1964). Aplikasi imunofluoresensi dalam Virologi Kesehatan Masyarakat. Ulasan Bakteriologis, 28 (4), 402–408.
7. Vrieling, EG, & Anderson, DM (1996). Imunofluoresensi dalam penelitian fitoplankton: aplikasi dan potensi. J: Phycol. , 32, 1–16.