APUSAN BAKTERI: KARAKTERISTIK DAN PREPARASI - BIOLOGI - 2025

The smear bakteri adalah ekstensi film tipis dari suspensi mikroorganisme bakteri yang dibuat di atas piring kaca transparan atau slide, untuk pengamatan di bawah mikroskop cahaya.

Perluasan dalam bentuk film dilakukan untuk sedapat mungkin memisahkan mikroorganisme, karena jika dikelompokkan maka pengamatannya tidak jelas.

Gambar 1. Apusan bakteri terlihat di bawah mikroskop elektron scanning. Sumber: pixbay.com

Dalam studi kultur bakteri, preparasi apusan, fiksasi dan teknik pewarnaan digunakan untuk menganalisisnya dengan lebih baik. Karena ukuran mikroorganisme yang kecil, penggunaan mikroskop optik diperlukan untuk pengamatannya.

Mikroskop optik adalah instrumen penting untuk mengamati noda. Ini menggunakan lensa optik dan cahaya yang memungkinkan tampilan sampel dengan pembesaran tinggi.

Secara umum, sel-sel hidup tidak memiliki sebagian besar struktur berwarna, terlihat dengan mikroskop cahaya bahwa mereka adalah sampel yang tidak berwarna dan transparan, dan mereka menunjukkan sangat sedikit kontras internal dan dengan lingkungannya.

Pengamatan dengan mikroskop optik medan terang sederhana, tanpa menggunakan teknik pewarnaan tambahan, sangat terbatas dan hanya digunakan dalam beberapa kasus, seperti dalam pengamatan pergerakan mikroorganisme.

Untuk pengamatan mikroorganisme yang optimal, keseimbangan harus dicapai antara kontras dan resolusi. Rincian sel tidak dapat dilihat di bawah mikroskop, bahkan dengan resolusi tinggi; Penggunaan pewarna diperlukan melalui teknik pewarnaan, yang memberikan kontras untuk pengamatan.

Karakteristik apusan bakteri berkualitas baik

Kontras luar biasa

Untuk mencapai kontras yang sangat baik terdapat mikroskop canggih yang disebut mikroskop kontras fase, mikroskop interferensi diferensial, dan mikroskop medan gelap. Jenis mikroskop ini digunakan untuk mengamati struktur bakteri seperti selubung dan filamen, antara lain.

Pewarnaan adalah teknik sederhana untuk meningkatkan kontras yang dicapai dengan mikroskop medan terang. Dalam teknik ini, noda yang berbeda dapat digunakan, yang secara signifikan meningkatkan pengamatan mikroskopis.

Pewarnaan dilakukan secara langsung pada apusan atau ekstensi suspensi mikroorganisme pada slide, yang sebelumnya dikeringkan dan difiksasi.

Perbaikan yang bagus

Fiksasi adalah teknik yang digunakan untuk menjaga struktur sel; menyebabkan inaktivasi mikroorganisme dan adhesi pada kaca slide. Ada beberapa perawatan fiksasi yang berbeda: fiksasi panas dan fiksasi kimiawi.

Fiksasi panas

Ini adalah metode yang paling banyak digunakan untuk mengamati noda bakteri. Teknik ini terdiri dari melewatkan suspensi bakteri dari apusan melalui nyala korek api. Teknik ini mampu mempertahankan morfologi luar bakteri, tetapi menghancurkan struktur internalnya.

Fiksasi kimiawi

Fiksasi kimiawi menggunakan bahan kimia pengawet, antara lain formaldehida atau formalin, etanol, dan asam asetat. Keuntungan menggunakan bahan pengikat kimiawi adalah pengawetan struktur sel internal mikroorganisme tercapai.

Gambar 2. Apus darah. Sumber: Bobjgalindo, dari Wikimedia Commons

Pewarnaan yang bagus

Prosedur yang paling umum untuk pewarnaan apusan yang sebelumnya dikeringkan dan difiksasi adalah pewarnaan positif atau sederhana, pewarnaan diferensial, dan pewarnaan negatif. Ada juga teknik khusus untuk pewarnaan struktur sel tertentu (kapsul, spora, flagela).

Pewarnaan positif atau pewarnaan sederhana

Pewarnaan positif atau sederhana adalah teknik pewarnaan smear yang paling banyak digunakan. Ini menggunakan pewarna yang memiliki kemampuan untuk mengikat struktur mikroba tertentu, memungkinkan mereka untuk diamati di bawah mikroskop.

Pewarna ini memiliki gugus kromofor (bagian berwarna) dalam struktur kimianya, dengan ikatan rangkap dan ikatan tunggal (konjugasi). Ikatan ini pada gilirannya dapat membentuk ikatan ionik atau kovalen dengan beberapa struktur seluler.

Pewarna yang digunakan dalam pewarnaan positif atau sederhana sebagian besar merupakan turunan kimiawi dari anilin (garam organik berwarna).

Di sisi lain, di antara pewarna kita dapat menemukan beberapa dengan pH basa dan yang lainnya dengan pH asam.

Pewarna dasar

Dalam pewarna dasar, gugus kromofor memiliki muatan listrik positif. Sebagian besar mikroorganisme prokariotik memiliki pH internal netral, dan permukaan selnya bermuatan negatif. Melalui interaksi elektrostatis ini, kromofor mengikat sel dan menodainya.

Contoh pewarna dasar adalah biru metilen, kristal violet, hijau perunggu, fuscin dasar, safranin, dan lain-lain.

Pewarna asam

Dalam pewarna asam, gugus kromofor memiliki muatan listrik negatif. Ini digunakan untuk mewarnai protein dengan gugus amino bermuatan positif. Contoh pewarna asam adalah acid fuscin, rose Bengal, Congo red, dan eosin.

Pewarnaan diferensial

Teknik pewarnaan diferensial terdiri dari penerapan dua pewarna dengan warna atau intensitas berbeda, untuk membedakan mikroorganisme yang berbeda di bawah mikroskop. Pewarnaan Gram dan pewarnaan tahan asam-alkohol adalah pewarnaan diferensial yang paling umum digunakan dalam bakteriologi.

Pewarnaan Gram digunakan sebagai uji pendahuluan untuk mengetahui bentuk, ukuran, pengelompokan sel, serta jenis dinding sel. Dengan menggunakan uji pewarnaan Gram, bakteri dinding sel diklasifikasikan menjadi bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif.

Pewarnaan negatif

Dalam teknik ini, pewarna kimia yang digunakan tidak menembus bagian dalam sel, tetapi membuat media tempat mikroorganisme muncul sebagai latar belakang hitam.

Dalam teknik pewarnaan negatif, noda dibuat dari setetes tinta India atau suspensi nigrosin, yang setelah dibiarkan mengering pada suhu kamar membentuk film buram menuju aliran cahaya. Dengan cara ini, mikroorganisme muncul sebagai bentuk terang dengan latar belakang gelap.

Persiapan

A. Smear

1.- Cuci slide dengan sangat baik, keringkan dengan kertas penyerap dan beri label. Label harus menunjukkan isi sediaan, tanggal dan nama orang yang memrosesnya.

2.- Nyalakan korek api dan sterilkan loop inokulasi dalam nyala api sampai merah cerah.

3.- Biarkan pegangannya dingin.

4.- Ambil tabung kultur bakteri, lepaskan tutupnya dan cepat lewati mulut tabung di dekat api pembakar (nyala api).

5.- Masukkan loop inokulasi ke dalam tabung yang berisi kultur bakteri dan ambil sampelnya.

6.- Jika biakan dalam medium cair, letakkan contoh yang diambil dengan gagang di tengah slide dan sebarkan secara hati-hati dalam lingkaran berdiameter kurang lebih 2 cm.

7.- Sterilkan loop inokulasi lagi.

8.- Biarkan noda mengering di udara.

9.- Ulangi langkah 3 hingga 8 tiga kali.

10.- Jika kultur dalam medium padat, setetes air suling harus ditempatkan sebelumnya pada slide. Ini dilakukan untuk mencampur sedikit sampel kultur yang diambil dengan loop inokulasi, seperti yang diarahkan pada langkah 2 hingga 5 (kondisi aseptik).

11.- Sebarkan sampel yang telah diencerkan dengan setetes air pada kaca objek dan ulangi tiga kali.

B. Fiksasi

1.- Tambahkan dua tetes metanol atau etanol absolut ke olesan kering - dari biakan dalam media cair -.

2.- Biarkan udara mengering dari korek api.

3.- Jika noda berasal dari kultur dalam medium padat, noda kering diperbaiki dengan panas, melewati itu 2 sampai 3 kali dengan cepat melalui bagian terpanas dari nyala api yang lebih ringan.

4.- Sentuh bagian bawah noda dengan bagian punggung tangan kiri (untuk orang yang kidal; jika tidak, gunakan tangan kanan) dan pastikan dingin.

C. Pewarnaan sederhana

1.- Tambahkan 2 tetes noda yang dipilih ke noda dan biarkan bekerja selama waktu yang diperlukan dalam protokol khusus untuk setiap noda (umumnya antara 1 dan 5 menit).

2.- Beberapa noda memerlukan penggunaan panas untuk pengaktifannya, dalam hal ini seseorang harus sangat berhati-hati saat memanaskan slide dalam nyala api yang lebih ringan (memanipulasi dengan penjepit dan hindari mendidih). Smear yang terlalu panas dapat merusak sel yang akan diamati.

3.- Hapus pewarna berlebih dengan mencuci dengan air suling dari picette. Keluarkan air cucian dengan mengetuk perlahan slide di tepinya, miringkan di atas meja kerja.

4.- Biarkan pengeringan udara.

5.- Bergantung pada jenis pengamatan, penutup kaca digunakan atau tidak pada tahap ini. Penutup penutup melindungi dan mengawetkan noda. Jika pengamatan pencelupan minyak dilakukan pada tahap ini, tidak ada penutup mata yang digunakan tetapi noda tidak dapat dipertahankan.

D. Pengawetan pasti dari apusan

1.- Celupkan apusan secara berturut-turut ke dalam setiap larutan yang ditunjukkan di bawah ini, selama minimal 5 menit. Tujuan dari "mandi" ini adalah untuk mengeringkan noda. Setiap reagen harus dikeringkan secara menyeluruh sebelum memasukkan noda ke dalam bak mandi berikutnya.

Urutan mandi dehidrasi adalah sebagai berikut:

1. Etanol 70%
2. Etanol 95%
3. Aseton murni
4. Campuran Aseton -xylol 1: 1
5. Xylol

Kemudian biarkan mengering.

2.- Pasang penutup kaca, sebaiknya 22 × 22 mm, menggunakan balsam Kanada atau media pemasangan lainnya.

Referensi

1. Briggs, G. (1965). Faktor Penyebab Kecelakaan dan Infeksi Laboratorium Mikrobiologi. Laboratorium Biologi Angkatan Darat AS. Fort Detrick.
2. Cappucino, JG dan Welch, CT (2017). Mikrobiologi: Manual Laboratorium. Pearson.
3. Holt, Editor JG. (1977). Manual Bakteriologi Penentu Bergey yang lebih pendek. 8 ^th Baltimore: The Williams and Wilkins Co.
4. Johnson, TR dan Case; CL (2018). Eksperimen Laboratorium dalam Mikrobiologi. Pearson.
5. Tille, P. (2017). Mikrobiologi Diagnostik. 14 ^th St. Louis, AS: Elsiever, Inc.