MÜELLER HINTON AGAR: DASAR, PERSIAPAN DAN PENGGUNAAN - BIOLOGI - 2025

The Mueller Hinton Agar tidak selektif, media nutrisi yang solid terdiri dari infus daging, asam kasein pepton, pati, agar dan air suling. Media ini memungkinkan pertumbuhan mikroba yang sangat baik untuk sebagian besar bakteri yang tumbuh cepat.

Ini awalnya dibuat oleh John Howard Müeller dan Jane Hinton untuk mengisolasi bakteri yang membutuhkan nutrisi seperti Neisseria gonorrhoeae dan Neisseria meningitidis. Namun, karena karakteristiknya, itu ternyata ideal untuk studi tentang kerentanan terhadap antibiotik, memberikan hasil yang andal dan dapat direproduksi.

Antibiogram (Müeller Hinton agar). Sumber: Dr Graham Beards di en.wikipedia

Oleh karena itu, Müeller Hinton Agar adalah media kultur yang diterima oleh Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) dan Komite Eropa untuk Pengujian Kerentanan Antimikroba, untuk kinerja uji kepekaan antimikroba dengan metode difusi cakram Kirby dan Bauer.

Dasar

Menjadi media nutrisi non-selektif, ini sangat baik untuk pertumbuhan sebagian besar bakteri patogen.

Di sisi lain, komposisinya yang sederhana membuat zat mudah berdifusi di atasnya, menjadi karakteristik penting untuk uji kepekaan dengan metode difusi cakram.

Karakteristik lainnya adalah mengandung sejumlah kecil inhibitor, yang memungkinkan sulfonamida, trimetoprim dan tetrasiklin dievaluasi secara efektif.

Namun, perlu diingat bahwa media harus memenuhi syarat-syarat tertentu agar dapat berfungsi dengan baik, antara lain:

Penyesuaian pH, kedalaman agar dan konsentrasi timin, timidin, Ca ⁺⁺ , Mg ⁺⁺ dan Zn ^{++ yang sesuai} .

Anda juga harus tahu bahwa metodologinya sudah terstandarisasi dan oleh karena itu semua parameter harus terpenuhi, seperti:

Konsentrasi inokulum, konsentrasi dan kekekalan cakram antibiotik, penempatan jumlah cakram yang sesuai pada agar-agar, jarak antara satu cakram dengan cakram lainnya, penempatan strategis antibiotik tertentu, atmosfer, suhu dan waktu inkubasi.

Persiapan

Timbang 37 g medium Müeller Hinton dehidrasi dan larutkan dalam 1 liter air suling. Panaskan media sambil diaduk untuk membantu pelarutan. Rebus selama 1 menit.

Autoclave untuk mensterilkan pada 121 ° C selama 15 menit. Saat mengeluarkan dari autoklaf, labu harus ditempatkan dalam penangas air pada suhu 50 ° C agar dingin. Tuang 25 sampai 30 ml ke dalam cawan petri steril berdiameter 10 cm.

Pelat harus dengan ketebalan rata-rata 4 mm (ideal), dengan kisaran 3-5 mm.

Jika ingin membuat agar darah menggunakan agar Müeller Hinton sebagai basis, tuangkan 5% darah domba steril dan defibrinated sebelum disajikan di piring.

PH akhir media harus antara 7,2 hingga 7,4.

Investasikan dan simpan di lemari es, sampai digunakan. Biarkan piring mencapai suhu kamar sebelum digunakan.

Warna media yang disiapkan adalah krem ​​muda.

Aplikasi

Ini digunakan untuk melakukan tes antibiotik atau kerentanan antibiotik untuk patogen non-permintaan yang tumbuh paling cepat.

Jika agar ditambah dengan darah, digunakan untuk melakukan antibiotikogram dari mikroorganisme yang membutuhkan seperti: Streptococcus pneumoniae, Haemophilus sp, Neisseria meningitidis, antara lain. Itu juga telah digunakan untuk mengisolasi Legionella pneumophila.

Teknik antibiotik

Sebelum melakukan antibiogram tersebut, solusi setara bakteri 1,5 x 10 ⁸ sel harus siap .

Untuk ini, 3 sampai 4 koloni dari kultur murni diambil dan disuspensikan dalam kaldu trypticase kedelai atau dalam kaldu Müeller Hinton, diinkubasi selama 2 sampai 6 jam dan konsentrasinya disesuaikan dengan larutan garam steril, membandingkannya dengan standar Mac Farland 0,5%.

Jika mereka membutuhkan mikroorganisme, koloni dapat langsung tersuspensi hingga konsentrasi 0,5% Mac Farland. Selanjutnya, pelat Müeller Hinton diunggulkan dengan kapas yang diresapi dengan larutan bakteri yang telah disiapkan.

Untuk melakukan ini, kapas dibenamkan ke dalam larutan dan kemudian cairan berlebih dihilangkan dengan menekan dinding tabung. Segera setelah itu, usapan dilewatkan ke seluruh permukaan, tidak menyisakan tempat yang tidak tersentuh, kemudian pelat diputar sedikit dan disemai lagi. Operasi diulangi 2 kali lagi.

Diamkan selama 10 menit lalu masukkan cakram antibiotik dengan penjepit steril, sisakan jarak 24 mm di antara keduanya. Setelah meletakkan setiap cakram pada agar-agar, tekan setiap cakram perlahan dengan penjepit untuk memastikannya menempel dengan baik.

Setelah proses selesai, pelat dibalik dan diinkubasi pada suhu 35-37 ° C dalam aerobiosis selama 16 hingga 18 jam. Jika merupakan mikroorganisme yang banyak menuntut, mungkin bermanfaat bagi mikroaerofilia dan jika antibiotikogram mengandung cakram oksasilin, itu harus dibaca setelah 24 jam.

Penggaris digunakan untuk mengukur diameter setiap halo. Hasilnya harus dicatat dalam mm. Selanjutnya, nilai yang diperoleh dikorelasikan dengan tabel titik potong yang diterbitkan oleh manual CLSI saat ini.

Pengukuran halo penghambatan. Sumber: USCDCP, Pixnio.com

Laporkan sebagai sensitif (S), menengah (I), atau tahan (R), tergantung kasusnya.

Antibiotik dipilih menurut mikroorganisme yang diisolasi dan jenis infeksi yang dihasilkannya.

Kadang-kadang penempatan strategis antibiotik harus diingat untuk mengungkapkan pola resistensi fenotipik.

Penempatan cakram strategis pada agar Müeller Hinton

Untuk enterobakteri, cakram asam klavulanat harus ditempatkan pada sefalosporin generasi ke-3 dan ke-4. Pelebaran berbentuk telur menunjukkan bahwa strain tersebut adalah penghasil beta-laktamase spektrum luas (ESBL). Artinya, pasien tidak boleh diobati dengan sefalosporin.

Ekspresi fenotipe produksi beta-laktamase spektrum luas (ESBL) dalam strain Escherichia coli. Sumber: Foto diambil oleh penulis MSc. Marielsa gil

Pada Staphylococcus, penting untuk menempatkan cakram eritromisin atau azitromisin di depan cakram klindamisin (uji-D).

Sebuah halo resisten pada eritromisin dan pendataran pada klindamisin halo menunjukkan bahwa strain tersebut memiliki strain inducible clindamycin resistance (ICR). Ini berarti pengobatan klindamisin tidak akan efektif.

Untuk mencari strain AMP C yang dapat diinduksi di Enterobacteriaceae dan beberapa batang Gram negatif non-fermentasi, cakram ceftazidime tazobactan, cefoxitin, atau piperasilin dihadapkan pada cakram imipenem, pada jarak 27 mm.

Lingkaran yang diratakan di salah satu disk yang menghadap imipenem menunjukkan adanya AMP C. yang dapat diinduksi.

Untuk pencarian C-AMP konstitutif, cakram cloxacillin 500 µg dihadapkan pada ceftazidime (30 µg) dan dengan sefotaksim (30 µg), pada jarak 25 mm. Lingkaran cahaya yang melebar di salah satu sefalosporin menunjukkan kepositifan.

Disk cloxacillin juga dapat diganti dengan disk 9 mm kertas saring Whatman No. 6 diresapi dengan fenil borat asam (400 µg) dengan jarak 18 mm. Ini ditafsirkan sama dengan yang sebelumnya.

Terakhir, untuk menyelidiki produksi metalobetalaktamase khususnya di Pseudomonas aeruginosa, digunakan sebuah cakram yang diresapi dengan 10 µl asam etilenadiaminetetraasetat (EDTA 750 µg) dan asam tioglikolat (SMA 300 µg), yang dihadapkan dengan cakram imipenem dan meropenem, pada jarak 15 mm.

Tesnya positif jika ada pelebaran halos imipenem atau meropenem menuju disk EDTA / SMA. Hasil ini harus dikonfirmasi oleh tes Hodge yang dimodifikasi.

Metode ini terdiri dari inokulasi strain Escherichia coli ATCC 25922 pada pelat Müeller Hinton. Cakram imipenem ditempatkan di tengah pelat dan kemudian garis dibuat dari cakram ke pinggiran dengan dugaan strain P. aeruginosa. Hingga 4 strain dapat diuji per piring.

Tes akan positif jika ada zona distorsi halo imipenem di sekitar stretch mark.

Penyebab hasil yang salah

- Cakram antibiotik yang tidak diawetkan dengan baik dapat menghasilkan resistensi palsu. Misalnya, cakram oksasilin sangat rentan terhadap perubahan suhu.

-A pH medium di bawah yang ditunjukkan (asam) menghasilkan lingkaran cahaya yang lebih kecil di aminoglikosida dan makrolida (risiko resistensi palsu), dan lingkaran cahaya yang lebih besar di penisilin, tetrasiklin, dan novobiosin (risiko sensitivitas palsu).

-Jika pH di atas yang ditunjukkan (basa), efek yang dijelaskan di atas akan dibalik.

-Media dengan konsentrasi timin dan timidin yang tinggi memiliki pengaruh dengan secara signifikan mengurangi halos penghambatan sulfonamida dan trimetoprim.

-Konsentrasi tinggi kalsium dan magnesium menghasilkan resistensi palsu dari aminoglikosida, polimiksin B dan tetrasiklin terhadap strain Pseudomonas aeruginosa.

Konsentrasi kalsium dan magnesium yang rendah menghasilkan sensitivitas palsu dari aminoglikosida, polimiksin B dan tetrasiklin terhadap strain Pseudomonas aeruginosa.

-Kehadiran seng mempengaruhi hasil cakram karbapenem (imipenem, meropenem dan ertapenem).

-Ketebalan medium di bawah 3mm akan menghasilkan hasil sensitivitas palsu, sedangkan ketebalan di atas 5 akan menghasilkan resistansi palsu.

-Mobilisasi cakram dalam antibiogram akan memberikan lingkaran cahaya yang cacat, karena antibiotik segera keluar.

- Inokulum yang sangat lemah mempengaruhi hasil, karena tidak akan ada pertumbuhan yang seragam atau konfluen pada agar-agar, kondisi yang diperlukan untuk dapat mengukur lingkaran cahaya penghambatan, selain fakta bahwa lingkaran cahaya dapat memberi lebih besar dari biasanya.

-Inokula yang dimuat secara berlebihan dapat memberikan lingkaran cahaya lebih kecil dari biasanya.

-Tidak menghargai jarak antar cakram menyebabkan satu halo tumpang tindih dengan yang lain dan tidak dapat dibaca dengan benar.

-Menginkubasi dengan CO ₂ meningkatkan ukuran lingkaran cahaya dari cakram tetrasiklin dan metisilin.

-Incubate pada suhu di bawah 35 ° C menghasilkan lingkaran cahaya yang lebih besar.

-Penambahan darah mengurangi ukuran sulfa halo.

Keterbatasan

Sensitivitas antibiotik yang ditunjukkan dalam antibiotikogram terhadap mikroorganisme (in vitro) bukanlah jaminan bahwa antibiotik akan bekerja secara in vivo.

QA

Untuk mengetahui apakah media mengandung timin dalam jumlah yang cukup, strain Enterococcus faecalis ATCC 29212 harus ditanam dan diuji kerentanannya terhadap trimetoprim sulfametoksazol (SXT), harus memberikan halo sama dengan atau> 20 mm agar memuaskan.

Referensi

1. "Müller-Hinton agar." Wikipedia, ensiklopedia gratis. 16 Nov 2018, 12:23 UTC. 27 Jan 2019 pada 04:22
2. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Diagnosis Mikrobiologis Bailey & Scott. 12 ed. Editorial Panamericana SA Argentina.
3. Cona E. Kondisi untuk studi kerentanan yang baik dengan uji difusi agar. Rev Chil Infect, 2002; 19 (2): 77-81
4. Laboratorium Difco Francisco Soria Melguizo. Müeller Hinton agar dengan 5% darah domba. 2009. Tersedia di: http://f-soria.es
5. Laboratorium Agar BD Müeller Hinton II. 2017. Tersedia di: .bd.com
6. Laboratorium Britannia. Müeller Hinton agar. 2015. Tersedia di: britanialab.com
7. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnosis Mikrobiologis. Edisi ke-5. Editorial Panamericana SA Argentina.
8. Martínez-Rojas D. AmpC-type betalactamases: Umum dan metode untuk deteksi fenotipik. Pendeta Soc. Ven. Mikrobiol. 2009; 29 (2): 78-83. Tersedia di: scielo.org.
9. Perozo A, Castellano M, Ling E, Arraiz N. Deteksi fenotipik metalobetalaktamase dalam isolat klinis Pseudomonas aeruginosa. Kasmera, 2012; 40 (2): 113-121. Tersedia di: scielo.org.