MANIK AGAR STANDAR: DASAR PEMIKIRAN, PERSIAPAN DAN PENGGUNAAN - BIOLOGI - 2025

The count agar standar adalah, non-selektif media kultur padat, dirancang untuk kuantifikasi beban hadir mikroba aerobik dalam sampel air minum, air limbah, minuman susu, antara lain makanan. Media ini juga dikenal sebagai agar PCA, untuk akronimnya dalam Agar Hitung Lempeng Inggris. Itu dibuat pada tahun 1953 oleh Buchbinder, Baris, dan Goldstein.

Media hitung agar standar terdiri dari ekstrak ragi, triptein, glukosa, agar, dan air suling. Formulasi ini mengandung elemen nutrisi dasar yang memungkinkan pengembangan beban mikroba aerobik saat ini, tidak menuntut.

Pengenceran desimal untuk menghitung CFU dalam jumlah agar standar. Sumber: Quentin Geissmann

Karena medianya tidak mengandung inhibitor, bakteri dapat tumbuh tanpa batasan apa pun, sehingga ideal untuk penghitungan koloni secara umum. Namun, teknik penghitungan plak tidak akan mendeteksi semua bakteri yang ada, tetapi hanya bakteri yang mampu tumbuh di bawah kondisi lingkungan di mana agar jumlah standar yang dibibitkan.

Dalam pengertian ini, teknik kuantifikasi lempeng pada umumnya berusaha untuk menentukan jumlah bakteri dari jenis mesofilik aerobik, yaitu yang tumbuh pada suhu antara 25 dan 40 ° C, dengan suhu pertumbuhan optimal 37 ° C. .

Kelompok bakteri ini sangat penting, karena sebagian besar bakteri patogen bagi manusia terdapat di sana.

Perlu dicatat bahwa terkadang menarik untuk mengukur jumlah bakteri psikrofilik yang ada dalam makanan. Bakteri ini adalah bakteri yang tumbuh pada suhu rendah (<20 ° C) dan bertanggung jawab menyebabkan makanan lebih cepat membusuk, bahkan saat disimpan di lemari es.

Demikian pula, bakteri termofilik, yang berkembang dalam kisaran antara 50 ° C hingga 80 ° C atau lebih, dapat menjadi penting dalam jenis makanan tertentu seperti makanan kaleng.

Kuantifikasi mikroba dinyatakan dalam unit pembentuk koloni (CFU) per gram atau mililiter sampel.

Dasar

Media hitung standar dirancang untuk memungkinkan keberhasilan pertumbuhan bakteri aerob non-rewel karena ekstrak ragi, triptein, dan glukosa memberikan nutrisi yang diperlukan untuk pertumbuhan mikroba yang baik.

Di sisi lain, medium memiliki warna terang dan tampilan transparan, sehingga ideal untuk visualisasi koloni yang dikembangkan dengan metode deep seeding (penuangan piring).

Penghitungan koloni dengan metode penyemaian permukaan spatula Drigalski juga dimungkinkan.

Ketika beban mikroba tinggi, pengenceran desimal dari sampel penelitian harus dilakukan untuk dapat menghitung CFU.

Perlu dicatat bahwa media ini direkomendasikan oleh American Public Health Association (APHA) untuk menghitung mesofil aerobik.

Persiapan

Timbang 23,5 g media dehidrasi dan larutkan dalam satu liter air suling. Agar larut sempurna, campuran harus dipanaskan dengan diaduk sesering mungkin hingga mendidih. Langkah selanjutnya tergantung pada teknik penyemaian yang akan digunakan.

Untuk teknik tuang-piring

Distribusikan dengan meracik 12 sampai 15 ml ke dalam tabung reaksi. Selanjutnya sterilkan dalam autoclave dengan suhu 121 ° C selama 15 menit. Biarkan mengeras secara vertikal dalam bentuk balok. Simpan di lemari es sampai digunakan.

Lelehkan steker saat Anda akan menggunakannya. Setelah meleleh, simpan dalam penangas air pada suhu 44-47 ° C sementara sampel disiapkan.

Untuk tabur permukaan

Sterilkan media dalam autoclave pada 121 ° C lalu distribusikan 20 ml dalam cawan petri steril. Biarkan mengeras, balikkan dan simpan di lemari es sampai digunakan.

Temper piring sebelum digunakan. PH media harus 7,0 ± 0,2.

Menggunakan

Standard Count Agar digunakan dalam teknik penghitungan mesofilik aerobik selama analisis mikrobiologi air dan makanan. Penghitungan mesofil aerobik diperlukan, karena ini menentukan kualitas sanitasi sampel yang diteliti.

Penerapan teknik ini (menggunakan media ini) memungkinkan visualisasi makroskopis dari koloni yang terisolasi untuk kuantifikasinya.

Teknik tuang piring (penyemaian dalam)

-Proses

Tekniknya terdiri dari:

1) Homogenisasi sampel untuk mendistribusikan kembali bakteri yang ada.

2) Suspensi awal dibuat dalam botol atau kantung steril, dengan memperhatikan perbandingan 10 gr atau 10 ml sampel dalam 90 ml pengencer (10 ^-1 ).

3) Dari suspensi awal, pengenceran desimal yang bersangkutan dibuat tergantung pada jenis sampel. Contoh: (10 ^-2 , 10 ^-3 , 10 ^-4 ). Pengenceran dibuat dengan air pepton atau buffer fosfat.

Untuk melakukan ini, ambil 1 ml suspensi awal dan tempatkan dalam 9 ml pengencer, lanjutkan pengenceran jika perlu, sekarang ambil 1 ml pengenceran 10 ^-2 dan seterusnya.

4) Ambil 1 ml masing-masing pengenceran dan tempatkan dalam cawan petri kosong yang steril.

5) Tambahkan ke setiap piring 12 hingga 15 ml agar count standar yang sebelumnya meleleh dan disimpan pada 44 - 47 ° C.

6) Dengan hati-hati putar pelat untuk mendistribusikan sampel di sepanjang agar-agar secara merata dan biarkan mengeras.

7) Balikkan pelat dan inkubasi pada 37 ° C dalam aerobiosis selama 24 hingga 48 jam.

8) Pada akhir waktu, pelat diperiksa dan koloni dihitung dalam pengenceran yang memungkinkan. Pelat yang memiliki antara 30 hingga 300 CFU dipilih untuk penghitungan.

Penghitungan dapat dilakukan secara manual atau menggunakan peralatan penghitung koloni.

Nilai yang diperbolehkan per ml sampel dapat bervariasi dari satu negara ke negara lain tergantung pada peraturan yang mengaturnya.

-Kalkulasi UFC

Perhitungan umum dilakukan dengan menggunakan rumus berikut:

Formula untuk perhitungan umum penghitungan CFU. Sumber: Administrasi Nasional Obat, Pangan dan Teknologi Medis (ANMAT). Analisis mikrobiologi makanan, metodologi analitik resmi, mikroorganisme indikator. 2014 Volume 3. Tersedia di: anmat.gov.ar

Nyatakan hasilnya dalam 1 atau 2 digit, dikalikan dengan basis 10 yang sesuai. Contoh: jika hasilnya 16.545 maka dibulatkan dari digit ketiga menjadi 17.000 dan akan diekspresikan sebagai berikut: 1.7 x 10 ⁴ . Sekarang, jika hasilnya 16.436, bulatkan menjadi 16.000 dan ekspresikan 1,6 x 10 ⁴ .

Teknik penyemaian permukaan

-Proses

-Inokular dengan 0,1 ml sampel langsung jika cairan, suspensi awal 10 ^-1 atau pengenceran berturut-turut 10 ^-2 , 10 ^-3 dll, di tengah cawan agar hitungan standar.

-Distribusikan sampel secara merata dengan spatula Drigalski atau batang kaca berbentuk L. Biarkan istirahat selama 10 menit.

-Balikkan pelat dan inkubasi secara aerob pada suhu 37 ° C selama 24 hingga 48 jam.

-Lanjutkan Menghitung koloni, pilih pelat yang berada dalam kisaran antara 20 - 250 CFU.

-Kalkulasi UFC

Untuk perhitungan, faktor pengenceran diterapkan, yaitu kebalikannya. Angka tersebut dibulatkan menjadi 2 digit signifikan (dibulatkan menurut digit ketiga) dan dinyatakan dalam pangkat basis 10. Misalnya, jika 224 CFU dihitung dalam sampel tanpa pengenceran (10 ^-1 ), 22 x 10 ¹ CFU dilaporkan , tetapi jika angkanya 225, 23 x 10 ¹ CFU dilaporkan.

Sekarang, jika 199 CFU dihitung dalam pengenceran 10 ^-3 , 20 x 10 ⁴ CFU akan dilaporkan, tetapi jika 153 CFU dihitung dalam pengenceran yang sama, 15 x 10 ⁴ CFU akan dilaporkan.

QA

Media kultur hitung standar dapat dievaluasi dengan menggunakan strain bersertifikat yang diketahui, seperti: Escherichia coli ATCC 8739, Staphylococcus aureus ATCC 6538, Bacillus subtilis ATCC 6633, Lactobacillus fermentum ATCC 9338, Staphylococcus epidermidis ATCC 12228, Shigella flexneri ATCC 12022.

Jika media kultur dalam kondisi optimal, pertumbuhan yang memuaskan diharapkan dalam semua kasus, kecuali L. fermentum, yang dapat memperoleh hasil yang teratur.

Untuk mengevaluasi sterilitas media kultur, satu atau dua piring dari setiap batch yang disiapkan (tanpa inokulasi) harus diinkubasi pada 37 ° C dalam aerobiosis selama 24 jam. Setelah waktu ini, tidak ada pertumbuhan atau perubahan warna pada medium.

Batasan

-Jangan melelehkan agar lebih dari sekali.

-Media yang disiapkan bisa bertahan hingga 3 bulan selama disimpan di lemari es dan terlindung dari cahaya.

-Media ini tidak cocok untuk mikroorganisme yang banyak menuntut atau anaerobik.

Referensi

1. Administrasi Nasional Obat, Pangan dan Teknologi Medis (ANMAT). Analisis mikrobiologi makanan, metodologi analitik resmi, mikroorganisme indikator. 2014 Volume 3. Tersedia di: anmat.gov.ar
2. Laboratorios Difco Francisco Soria Melguizo, Agar Hitung Lempeng SA. 2009. Tersedia di: http://f-soria.es
3. Laboratorium Conda Pronadisa. Standard Method Agar (PCA) sesuai dengan APHA dan ISO 4833. Tersedia di: condalab.com
4. Laboratorium Britannia. Jumlah piring agar-agar. 2015. Tersedia di: britanialab.com
5. Camacho A, Giles M, Ortegón A, Palao M, Serrano B dan Velázquez O. 2009. Teknik untuk Analisis Mikrobiologi Makanan. Edisi ke-2. Fakultas Kimia UNAM. Mexico. Tersedia di: depa.fquim.unam