DNA REKOMBINAN: TEKNIK, APLIKASI, DAN FUNDAMENTAL - BIOLOGI - 2025

The DNA rekombinan (rDNA atau rDNA) merupakan molekul asam nukleat buatan dibuat di laboratorium, dengan mengintegrasikan dua segmen dari organisasi kepentingan. Ia juga dikenal sebagai DNA chimeric, berkat properti hibridanya. Jenis DNA ini tidak ditemukan di alam.

Metodologi dasar untuk menghasilkannya meliputi: (a) pemilihan DNA target, dan penyisipannya ke dalam fragmen DNA lain (umumnya plasmid bakteri); (b) masuknya plasmid ini ke dalam bakteri, (c) pemilihan bakteri dengan antibiotik dan terakhir (d) ekspresi gen.

Sumber: pixabay.com

Teknik ini memanfaatkan serangkaian enzim yang memungkinkan untuk menyalin dan menempelkan fragmen DNA tertentu menurut penilaian peneliti.

Tujuan dari teknologi rekombinan, dalam banyak kasus, ekspresi protein (dikenal sebagai protein rekombinan) yang diinginkan oleh ahli biologi molekuler untuk penelitian di masa depan atau untuk membuat protein dengan nilai komersial dan terapeutik - seperti insulin manusia, sebagai contoh.

Dasar-dasar teknik DNA rekombinan dan penggunaannya dalam rekayasa genetika

Dogma sentral biologi molekuler

Semua makhluk hidup yang kita kenal memiliki beberapa karakteristik. Salah satunya adalah sifat materi genetik dan cara protein dibuat - sebuah proses yang dikenal sebagai “dogma” sentral biologi molekuler.

Dengan pengecualian beberapa virus, semua organisme menyimpan informasi genetik dalam DNA (asam deoksiribonukleat), dikumpulkan dengan cara yang sangat kompak dan terorganisir di dalam inti sel.

Untuk ekspresi gen, molekul DNA ditranskripsikan menjadi messenger RNA, dan yang terakhir diterjemahkan ke dalam bahasa asam amino, bahan penyusun protein.

Apa itu DNA rekombinan?

Antara 1970-an dan 1980-an, ahli biologi molekuler mulai memanfaatkan proses yang secara alami terjadi di dalam sel dan mampu mengekstrapolasinya ke laboratorium.

Dengan cara ini, gen yang berasal dari hewan (vertebrata, misalnya) dapat disisipkan ke dalam segmen DNA dari suatu bakteri; atau DNA suatu bakteri dapat digabungkan dengan DNA virus. Jadi, kita dapat mendefinisikan DNA rekombinan sebagai molekul yang terdiri dari DNA dari dua organisme berbeda.

Setelah molekul hibrid atau rekombinan ini dibuat, gen yang diinginkan akan diekspresikan. Dengan ekspresi kata kami ingin merujuk pada proses penerjemahan menjadi protein.

Enzim restriksi dan ligase: kunci proses

Elemen kunci dalam mengembangkan teknologi DNA rekombinan adalah penemuan enzim restriksi.

Ini adalah molekul protein yang menunjukkan kemampuan untuk membelah DNA (nuklease) menjadi urutan tertentu, berfungsi sebagai "gunting molekuler". Fragmen yang dihasilkan oleh enzim ini disebut fragmen restriksi.

Enzim tersebut dapat menghasilkan potongan simetris dalam urutan target (di kedua rantai pada ketinggian yang sama) atau potongan asimetris. Aspek kunci dari aksi enzim restriksi adalah bahwa setelah rantai dibelah, "tepi longgar" diperoleh, melengkapi tepi lain yang dipotong oleh enzim yang sama.

Beberapa contohnya adalah ECOR 1 dan Sma 1. Saat ini lebih dari 200 jenis enzim restriksi telah dikenal dan tersedia secara komersial.

Agar bermanfaat, gunting harus disertai lem. Tindakan penyegelan DNA ini (sebelumnya diperlakukan dengan enzim restriksi) dilakukan oleh ligase.

Teknik: bagaimana DNA suatu organisme dimodifikasi secara artifisial di laboratorium?

Di bawah ini kami akan menjelaskan langkah-langkah utama yang dibutuhkan oleh teknologi DNA rekombinan. Semuanya dilakukan oleh para profesional di laboratorium biologi molekuler.

Apa itu "klon"?

Sebelum melanjutkan dengan protokol eksperimental, kita harus mencatat bahwa dalam biologi molekuler dan bioteknologi istilah "klon" dan kata kerja "klon" digunakan secara luas. Ini bisa menimbulkan kebingungan.

Dalam konteks ini, kami tidak mengacu pada kloning seluruh organisme (seperti dalam kasus domba Dolly yang terkenal, misalnya), tetapi pada kloning sepotong DNA, yang bisa menjadi gen. Artinya, menghasilkan banyak salinan - identik secara genetik - dari urutan tersebut.

1. Isolasi dan perolehan DNA

Langkah pertama adalah memutuskan urutan mana yang ingin Anda gunakan. Ini sepenuhnya tergantung pada peneliti dan tujuan karyanya. DNA ini kemudian harus diisolasi dan dimurnikan. Metode dan prosedur untuk mencapai hal ini bergantung pada tubuh dan jaringan.

Umumnya, sepotong jaringan diambil dan diberi perlakuan dalam buffer lisis dengan proteinase K (enzim proteolitik) dan kemudian DNA diekstraksi. Selanjutnya, materi genetik terfragmentasi menjadi fragmen-fragmen kecil.

2. Vektor kloning

Setelah melalui langkah-langkah persiapan, peneliti berupaya untuk memperkenalkan segmen DNA yang diminati ke dalam vektor kloning. Mulai sekarang kita akan menyebut segmen DNA DNA putih ini.

Plasmid

Salah satu vektor yang paling banyak digunakan dalam plasmid asal bakteri. Plasmid adalah molekul DNA melingkar beruntai ganda yang ditemukan secara alami pada bakteri. Mereka asing bagi kromosom bakteri - yaitu ekstrachromosomal, dan ditemukan secara alami di prokariota ini.

Unsur-unsur dasar vektor adalah: (a) asal replikasi, yang memungkinkan sintesis DNA; (b) agen seleksi, yang memungkinkan untuk mengidentifikasi organisme yang membawa plasmid dengan DNA target, seperti resistensi terhadap beberapa antibiotik; dan (c) situs multicloning, di mana sekuens yang akan dikenali oleh enzim restriksi ditemukan.

DNA rekombinan pertama yang berhasil di laboratorium diklon ke dalam plasmid pSC101 dari bakteri E. coli. Ini berisi situs restriksi untuk enzim restriksi EcoRI dan gen resistensi terhadap antibiotik, selain asal replikasi.

Penyisipan DNA target dalam plasmid dilakukan dengan menggunakan alat molekuler dari enzim restriksi dan ligase yang dijelaskan pada bagian sebelumnya.

Jenis vektor yang tersisa

Selain plasmid, DNA dapat dimasukkan ke dalam vektor lain, seperti bakteriofag lambda, kosmid, YAC (kromosom buatan ragi), BAC (kromosom buatan bakteri), dan fagemid.

3. Pengenalan DNA rekombinan

Setelah molekul DNA rekombinan (gen yang menarik dalam plasmid atau vektor lain) diperoleh, ia dimasukkan ke dalam organisme inang atau inang, yang dapat berupa bakteri.

Untuk memasukkan DNA asing ke dalam bakteri, teknik yang disebut transformasi bakteri digunakan, di mana organisme tersebut mengalami perlakuan dengan kation divalen yang membuatnya rentan terhadap pengambilan DNA.

Secara metodologis, kami tidak dapat menjamin bahwa 100% bakteri dalam kultur kami telah secara efektif mengambil molekul DNA rekombinan kami. Di sinilah bagian dari plasmid yang mengandung resistensi antibiotik ikut berperan.

Dengan demikian, bakteri yang telah mengambil plasmid akan kebal terhadap antibiotik tertentu. Untuk memilih mereka, cukup menggunakan antibiotik tersebut dan mengambil yang selamat.

4. "Memanen" protein

Setelah memilih bakteri dengan DNA rekombinan kami, kami melanjutkan menggunakan mesin enzimatis inang untuk menghasilkan produk protein yang diinginkan. Saat bakteri berkembang biak, plasmid diteruskan ke keturunannya, sehingga tidak hilang selama pembelahan.

Prosedur ini menggunakan bakteri sebagai semacam "pabrik" protein. Nanti kita akan melihat bahwa itu telah menjadi prosedur yang sangat relevan dalam pengembangan perawatan medis yang efektif.

Setelah kultur siap dan bakteri telah menghasilkan protein dalam jumlah besar, sel akan lisis atau terganggu. Ada berbagai macam teknik biokimia yang memungkinkan pemurnian protein menurut karakteristik fisikokimianya.

Dalam konteks eksperimental lain, kami mungkin tidak tertarik untuk menghasilkan protein, tetapi kami tertarik untuk mendapatkan urutan DNA itu sendiri. Jika ini masalahnya, plasmid akan digunakan untuk membuat banyak salinan fragmen yang diinginkan agar memiliki cukup DNA target untuk melakukan eksperimen yang relevan.

Aplikasi

Teknologi DNA rekombinan membuka kemungkinan tak terbatas dalam biologi molekuler, bioteknologi, kedokteran, dan bidang terkait lainnya. Aplikasinya yang paling menonjol adalah sebagai berikut.

Analisis genetik

Aplikasi pertama berhubungan langsung dengan laboratorium biologi molekuler. Teknologi DNA rekombinan memungkinkan para peneliti memahami fungsi normal gen, dan protein yang dihasilkan dapat digunakan dalam penelitian lebih lanjut.

Industri farmasi

Protein yang diproduksi menggunakan prosedur DNA rekombinan memiliki aplikasi dalam pengobatan. Dua contoh yang sangat relevan di lapangan adalah insulin manusia dan hormon pertumbuhan, yang diterapkan pada pasien yang kekurangan protein ini.

Berkat DNA rekombinan, protein ini dapat dihasilkan tanpa perlu mengekstraknya dari manusia lain, yang merupakan komplikasi metodologi tambahan dan risiko kesehatan. Ini telah membantu meningkatkan kualitas hidup banyak pasien.

Referensi

1. Baca, LEL, & Álvarez, CLC (2015). Biologi 2. Grupo Editorial Patria.
2. Cooper, GM, Hausman, RE, & Hausman, RE (2000). Sel: pendekatan molekuler (Vol. 10). Washington, DC: Pers ASM.
3. Devlin, TM (2004). Biokimia: buku teks dengan aplikasi klinis. Saya terbalik.
4. Khan, S., Ullah, MW, Siddique, R., Nabi, G., Manan, S., Yousaf, M., & Hou, H. (2016). Peran Teknologi DNA Rekombinan untuk Meningkatkan Kehidupan. Jurnal genomik internasional, 2016, 2405954.
5. Mindán, FP, & Mindan, P. (1996). Anatomi patologis. Elsevier Spanyol.
6. Tortora, GJ, Funke, BR, & Case, CL (2007). Pengantar mikrobiologi. Panamerican Medical Ed.
7. The, MJ (1989). Insulin manusia: obat pertama teknologi DNA. American Journal of Health-System Pharmacy, 46 (11_suppl), S9-S11.