PENGURUTAN DNA: MAXAM-GILBERT, METODE DAN CONTOH - BIOLOGI - 2025

The DNA sequencing (asam deoksiribonukleat) adalah prosedur di laboratorium biologi molekuler yang memungkinkan untuk mengetahui urutan nukleotida dalam materi genetik yang menarik. Selanjutnya, urutan RNA (asam ribonukleat) juga dapat diungkapkan.

Teknik ini sangat diperlukan untuk pengembangan ilmu biologi. Ini juga berlaku untuk bidang pengetahuan lain - seperti diagnosis medis dan penyelidikan forensik, misalnya.

Sumber: pixabay.com

Sebelumnya, sekuensing untai DNA dianggap sebagai aktivitas yang lambat dan mahal, yang memungkinkan identifikasi hanya beberapa pasangan basa di oligonukleotida.

Saat ini, dengan semua kemajuan ilmu pengetahuan, pengurutan DNA merupakan operasi rutin di banyak laboratorium di seluruh dunia berkat kontribusi penelitian selama hampir 50 tahun di bidang ini. Dalam hal panjang rantai, hingga jutaan pasangan basa dapat diurutkan dalam waktu yang sangat singkat.

Untuk melakukan ini, ada lusinan teknik yang dikembangkan dengan harga dan presisi yang bervariasi. Dalam artikel ini, kami akan menjelaskan teknik klasik dan modern, masing-masing dengan kelebihan dan kekurangannya.

Hingga saat ini, teknik sekuensing memungkinkan untuk memperoleh urutan genom lengkap, dari prokariota kecil dan ragi hingga genom manusia.

Struktur DNA

Untuk memahami metode dan teknik yang digunakan untuk sekuensing DNA, perlu diketahui aspek kunci tertentu dari struktur dan komposisi molekul.

DNA adalah biomolekul yang ditemukan di semua makhluk hidup, dari bakteri hingga hewan air besar. Organel - seperti mitokondria dan kloroplas - memiliki molekul DNA melingkar di dalamnya. Bahkan pada beberapa virus, materi genetik yang ditemukan adalah DNA.

Secara struktural, DNA adalah kumpulan nukleotida. Masing-masing terdiri dari karbohidrat, basa nitrogen (A, T, C atau G) dan gugus fosfat. Tujuan pengurutan DNA adalah untuk mengungkapkan urutan di mana empat basa nitrogen ditemukan dalam urutan tersebut.

Sejarah

Pada pertengahan 1950-an, peneliti Watson dan Crick mendeskripsikan struktur DNA menggunakan teknik kristolografik. Namun, tak satu pun dari peneliti ini yang dapat menemukan cara untuk mengungkap urutan tersebut.

Meskipun ada pendahulu tertentu, peristiwa terpenting adalah penciptaan metode Sanger, pada tahun 1977. Frederick Sanger, bapak metode tersebut, adalah seorang ahli biokimia Inggris, pemenang dua hadiah Nobel atas kontribusinya yang sangat besar pada ilmu biologi.

Teknik ini juga dikenal dalam literatur sebagai "penghentian rantai" atau dideoxynucleotides. Prinsip-prinsip teknik ini dan yang dikembangkan berdasarkan perbaikan dan inovasinya akan dijelaskan di bawah ini.

Metode Sanger

Perkembangan metode Sanger merupakan peristiwa penting dalam biologi molekuler. Ini melibatkan komponen dasar dari proses replikasi DNA yang biasanya terjadi di dalam sel, tetapi menambahkan komponen khusus: dideoxynucleotides.

Komponen utama reaksi

- DNA polimerase: enzim DNA polimerase adalah elemen penting dari proses tersebut. Molekul ini berpartisipasi dalam replikasi untai DNA dan perannya adalah sintesis untai baru, memasangkan deoksiribonukleotida trifosfat dengan yang komplementer.

Ingatlah bahwa dalam DNA, timin (T) berpasangan dengan adenin (A) melalui dua ikatan hidrogen, sedangkan sitosin (C) melakukannya dengan guanin (G) melalui tiga ikatan.

- Nukleotida: Pengurutan sanger melibatkan dua jenis nukleotida, empat 2'-deoxynucleotides (disingkat dATP, dGTP, dCTP dan dTTP) dan empat dideoxynucleotides (ddATP, ddGTP, ddCTP dan ddTTP).

Meskipun dideoksinukleotida mirip dengan monomer yang biasanya dimasukkan ke dalam DNA, mereka tidak memiliki gugus -OH dalam strukturnya. Ini membuat tidak mungkin untuk menambahkan nukleotida baru ke rantai.

Oleh karena itu, ketika nukleotida khusus ditambahkan - dengan cara yang benar-benar acak - ke rantai dalam formasi, sintesisnya menjadi lumpuh. Jadi, pada akhir reaksi, terdapat rantai dengan ukuran berbeda, masing-masing rantai dihentikan pada titik yang berbeda.

Secara eksperimental, empat tes disiapkan. Masing-masing berisi DNA yang diekstrak dari sampel biologis yang diinginkan, nukleotida normal, dan salah satu dari empat jenis nukleotida khusus. Salah satu nukleotida khusus ditandai dengan beberapa jenis penanda fluoresen (lihat pengurutan otomatis di bawah).

Membaca hasilnya

Langkah pertama adalah memisahkan setiap rantai yang disintesis menurut ukurannya. Beberapa akan lebih panjang dari yang lain, tergantung di mana pangkalan khusus itu dimasukkan.

Ada teknik biokimia berbeda yang memungkinkan pemisahan komponen campuran menggunakan ukuran sebagai sifat diskriminatif. Dalam metode Sanger, rantai yang berbeda dipisahkan dengan elektroforesis. Dalam varian teknik yang lebih canggih, elektroforesis kapiler digunakan.

Jadi, untaian yang lebih panjang bergerak lebih sedikit daripada varian yang lebih pendek. Sistem ini kemudian melewati alat pembaca yang mengenali penanda yang disertakan dalam setiap dideoksinukleotida. Dengan cara ini, urutan urutannya bisa diketahui.

Teknik "generasi pertama" ini mampu membaca fragmen DNA tidak lebih dari 1 kilobase. Saat ini, metode Sanger digunakan di berbagai laboratorium, umumnya dalam varian modern. Selain itu, digunakan untuk menguatkan hasil yang diperoleh dengan teknik yang paling rumit - tetapi kurang tepat.

Pengurutan otomatis

Saat pengurutan diperlukan dalam skala besar, prosesnya dipercepat melalui otomatisasi. Ini adalah variasi dari metode penghentian rantai Sanger, di mana primer diberi label dengan produk fluoresen untuk membedakannya.

Selanjutnya, produk reaksi dijalankan dalam elektroforesis - semuanya pada satu jalur. Saat setiap fragmen keluar dari bagian akhir gel, itu dengan cepat diidentifikasi oleh label fluoresennya, dengan kesalahan sekitar 1%.

Sistem yang paling canggih memiliki sistem hingga 96 tabung kapiler yang dikelola oleh komputer yang digabungkan dengan robot. Artinya, 96 sampel DNA bisa diuji secara bersamaan. Dengan demikian, proses yang melibatkan elektroforesis dan analisis hasil sepenuhnya otomatis.

Dalam satu hari, sistem ini dapat mengurutkan hingga 550.000 basis. Selama proses tersebut, tenaga manusia tidak diperlukan, hanya membutuhkan waktu sekitar 15 menit untuk memulai metode.

Pengurutan Maxam-Gilbert

Di saat Sanger mempublikasikan karyanya, dua peneliti bernama Allan Maxan dan Walter Gilbert berhasil mengembangkan metode lain untuk mendapatkan sekuens DNA. Metode ini mendapatkan popularitas pada saat itu, tetapi kemudian digantikan oleh peningkatan metode Sanger.

Berlawanan dengan metode Sanger, pengurutan Maxan dan Gilbert (atau pengurutan kimiawi, seperti yang juga dikenal) tidak melibatkan reaksi hibridisasi. Metodologi terdiri dari pelabelan dengan agen reaktif di salah satu ujungnya, diikuti dengan proses pemurnian.

Salah satu aspek negatif dari teknik ini terletak pada kompleksitasnya yang sangat besar dan penggunaan bahan kimia yang berbahaya bagi penggunanya. Pemutusan kimiawi diinduksi dengan penerapan DMS, asam format, hidrazin, dan hidrazin dengan garam.

Proses

Protokol dimulai dengan penandaan pada ujung 5 'untai dengan penanda fosfor (32), kemudian terjadi modifikasi kimiawi dari basa nitrogen dan dipisahkan. Akhirnya, pembelahan daerah abasic terjadi.

Pertama Anda mempersingkat string yang ingin Anda urutkan menjadi segmen yang lebih kecil. Langkah ini dilakukan dengan enzim restriksi, yang menghasilkan ujung yang menonjol.

Selanjutnya, reaksi dilakukan dengan alkali fosfatase, yang tujuannya adalah untuk menghilangkan gugus fosfat. Jadi, polinukleotida kinase dapat digunakan untuk melakukan pelabelan.

Rantai didenaturasi (dua untai terbuka). Kemudian bahan kimia diterapkan. Reaksi pembelahan ini dilakukan secara terkontrol dan diketahui jenis ikatan apa yang dipecah setiap bahan kimia yang diterapkan.

Membaca hasilnya

Seperti dalam metode Sanger, pembacaan hasil melibatkan pemisahan berdasarkan ukuran rantai yang diperoleh dalam sistem elektroforesis. Sistem yang terdiri dari poliakrilamida memungkinkan diperoleh resolusi yang sangat memadai untuk membaca gel.

Pengurutan massal

Pengurutan besar-besaran mencakup serangkaian metode baru, disingkat NGS, dari bahasa Inggris "Pengurutan Generasi Berikutnya".

Metode yang diklasifikasikan sebagai NGS memerlukan langkah amplifikasi DNA sebelumnya (tidak bekerja dengan satu molekul). Selain itu, platform yang digunakan sangat bervariasi. Prinsip metode paling populer akan dijelaskan di bawah ini:

Pyrosequencing

Ini melibatkan pemantauan pelepasan pirofosfat, yang terjadi setiap kali nukleotida baru ditambahkan ke untai DNA. Suatu sistem enzim digabungkan, sehingga emisi cahaya (yang dapat dideteksi oleh kamera) terjadi setiap kali nukleotida baru dimasukkan.

Prosesnya dimulai dengan inkubasi terpisah dari setiap basa nitrogen untuk memverifikasi apakah ada emisi cahaya atau tidak. Pyrosequencing dapat membaca untaian panjang, tetapi tingkat kesalahan yang ditemukan tinggi.

Pengurutan sintesis

Ini melibatkan penggabungan nukleotida berlabel. Komponen fluoresen ini ditambahkan, dicuci, dan nukleotida yang tergabung dicatat. Kemudian, label nukleotida dihilangkan, dan sintesis untai dapat dilanjutkan. Pada langkah berikutnya, nukleotida berlabel juga akan digabungkan, dan langkah-langkah yang disebutkan di atas akan diulangi.

Kelemahan dari teknik ini terjadi jika penanda fluoresen tidak sepenuhnya dihilangkan. Emisi ini menciptakan kesalahan latar belakang, yang mengakibatkan kesalahan yang signifikan.

Pengurutan ligasi

Teknik ini berbeda dari yang lain, karena tidak menggunakan DNA polimerase. Sebaliknya, enzim kunci untuk metodologi ini adalah ligase. Di sini, fragmen DNA berlabel fluoresen digunakan, dihubungkan oleh enzim dan dideteksi.

Masalah terbesar dengan teknik ini adalah panjang fragmen pendek yang mampu diprosesnya.

Pengurutan Torrent Ion

Teknik ini didasarkan pada pengukuran ion H ⁺ yang dilepaskan setiap kali nukleotida baru dimasukkan. Prinsipnya sangat mirip dengan pyrosequencing, tetapi jauh lebih murah.

Contoh

Pengurutan genom manusia

Pengurutan genom manusia telah menjadi salah satu tantangan paling menjanjikan dalam biologi, sekaligus menjadi salah satu persaingan paling terkenal dalam sejarah sains. Faktanya, bagi para ilmuwan yang terlibat dalam proyek ini, pengurutan genom menjadi sebuah kompetisi.

Pada tahun 1990 ia memulai apa yang disebut "proyek genom manusia", dipimpin oleh ilmuwan terkenal, pemenang Hadiah Nobel, James Watson. Setelah setahun, pada tahun 1991, Venter mengambil tantangan "mengalahkan" Watson dan mengurutkan genom di depannya. Namun, pada tahun 1992, Watson pensiun dan perintah diambil oleh peneliti lain.

Pada tahun 1995 Venter mengumumkan keberhasilannya dalam pengurutan lengkap genom bakteri dengan metode pengurutan acak. Demikian pula, tim lawan mengumumkan setahun kemudian sekuensing genom ragi.

Pada tahun 2000, gelar tersebut dihentikan. Kedua perusahaan menerbitkan seluruh hasil genom awal mereka di dua jurnal sains paling bergengsi: Nature and Science.

Namun, para ilmuwan terus bekerja untuk meningkatkan proposal tersebut, dan pada tahun 2006 urutan kromosom manusia tertentu diselesaikan.

Pentingnya dan aplikasi

Mengetahui urutan nukleotida dari molekul penting seperti DNA sangat berharga bagi ahli biologi dan profesional terkait. Rantai polinukleotida ini berisi semua informasi yang diperlukan untuk pengembangan dan pemeliharaan semua bentuk kehidupan.

Untuk alasan ini, pengetahuan tentang urutan ini sangat penting untuk penelitian biologi. Pada dasarnya, pengurutan memungkinkan untuk mengukur salah satu sifat terpenting dari sistem biologis dan untuk menetapkan perbedaan di antara mereka.

Pengurutan digunakan secara luas oleh ahli taksonomi dan ahli sistematika, karena urutan DNA tertentu memungkinkan penetapan kriteria untuk menyimpulkan apakah dua organisme termasuk dalam spesies yang sama atau tidak, selain untuk dapat mengajukan hipotesis tentang hubungan filogenetik di antara mereka.

Selain itu, pengurutan DNA memiliki aplikasi dalam pengobatan dan diagnostik. Misalnya, ada sistem yang murah dan dapat diakses yang, melalui pengurutan, memungkinkan untuk menilai kecenderungan untuk mengembangkan penyakit tertentu (seperti kanker) menggunakan apa yang disebut polimorfisme nukleotida tunggal (SNP).

Investigasi kriminal dan forensik juga telah diperkaya dengan teknik pengurutan, yang dapat digunakan sebagai bukti yang dapat dipercaya dari partisipasi individu tertentu dalam suatu kejahatan.

Referensi

1. Heather, JM, & Chain, B. (2016). Urutan sequencer: sejarah sekuensing DNA. Genomics, 107 (1), 1-8.
2. Koboldt, DC, Steinberg, KM, Larson, DE, Wilson, RK, & Mardis, ER (2013). Revolusi pengurutan generasi berikutnya dan dampaknya pada genomik. Sel, 155 (1), 27-38.
3. Levy, J. (2010). Persaingan ilmiah. Dari Galileo ke proyek genom manusia. Editorial Paraninfo.
4. Sanger, F., Nicklen, S., & Coulson, AR (1977). Pengurutan DNA dengan penghambat penghenti rantai. Prosiding akademi ilmu nasional, 74 (12), 5463-5467.
5. Schuster, SC (2007). Pengurutan generasi berikutnya mengubah biologi saat ini. Metode alam, 5 (1), 16.
6. Xu, J. (Ed.). (2014). Pengurutan generasi berikutnya. Caister Academic Press.