ENZIM RESTRIKSI: FUNGSI, JENIS, DAN CONTOH - BIOLOGI - 2025

The enzim restriksi yang endonuklease yang digunakan oleh archaea dan bakteri tertentu untuk menghambat atau "membatasi" penyebaran virus dalam. Mereka sangat umum pada bakteri dan merupakan bagian dari sistem pertahanan mereka terhadap DNA asing yang dikenal sebagai sistem restriksi / modifikasi.

Enzim ini mengkatalisasi pembelahan DNA pita ganda di lokasi tertentu, dapat direproduksi dan tanpa menggunakan energi tambahan. Sebagian besar membutuhkan keberadaan kofaktor seperti magnesium atau kation divalen lainnya, meskipun beberapa juga membutuhkan ATP atau S-adenosyl methionine.

Skema reaksi enzim restriksi HindIII (Sumber: Helixitta via Wikimedia Commons)

Endonuklease restriksi ditemukan pada tahun 1978 oleh Daniel Nathans, Arber Werner dan Hamilton Smith, yang menerima Hadiah Nobel dalam bidang kedokteran atas penemuan mereka. Nama mereka umumnya berasal dari organisme tempat mereka pertama kali diamati.

Enzim semacam itu banyak digunakan dalam pengembangan metode kloning DNA dan biologi molekuler serta strategi rekayasa genetika lainnya. Karakteristik pengenalan urutan spesifik mereka dan kemampuan untuk memotong urutan di dekat situs pengenalan menjadikannya alat yang ampuh dalam eksperimen genetik.

Fragmen yang dihasilkan oleh enzim restriksi yang bekerja pada molekul DNA tertentu dapat digunakan untuk membuat ulang "peta" molekul asli dengan menggunakan informasi tentang tempat enzim memotong DNA.

Beberapa enzim restriksi mungkin memiliki tempat pengenalan yang sama pada DNA, tetapi mereka tidak memotongnya dengan cara yang sama. Jadi, ada enzim yang memotong ujung tumpul dan enzim yang memotong meninggalkan ujung kohesif, yang memiliki aplikasi berbeda dalam biologi molekuler.

Saat ini terdapat ratusan enzim restriksi berbeda yang tersedia secara komersial, ditawarkan oleh rumah komersial yang berbeda; Enzim ini berfungsi sebagai gunting molekul "khusus" untuk tujuan yang berbeda.

fitur

Enzim restriksi memenuhi fungsi kebalikan dari polimerase, karena enzim tersebut menghidrolisis atau memutus ikatan ester dalam ikatan fosfodiester antara nukleotida yang berdekatan dalam rantai nukleotida.

Dalam biologi molekuler dan rekayasa genetika, mereka banyak digunakan sebagai alat untuk konstruksi vektor ekspresi dan kloning, serta untuk identifikasi urutan tertentu. Mereka juga berguna untuk pembangunan genom rekombinan dan memiliki potensi bioteknologi yang besar.

Kemajuan terbaru dalam terapi gen menggunakan enzim restriksi saat ini untuk memasukkan gen tertentu ke dalam vektor yang merupakan kendaraan untuk pengangkutan gen tersebut ke dalam sel hidup, dan yang mungkin memiliki kemampuan untuk masuk ke dalam genom seluler untuk melakukan perubahan permanen.

Mekanisme aksi

Enzim restriksi dapat mengkatalisasi pembelahan DNA pita ganda, meskipun beberapa mampu mengenali urutan DNA pita tunggal dan bahkan RNA. Pemotongan terjadi setelah pengenalan urutan.

Mekanisme kerjanya terdiri dari hidrolisis ikatan fosfodiester antara gugus fosfat dan deoksiribosa pada kerangka setiap untai DNA. Banyak enzim yang mampu memotong di tempat yang sama dengan yang mereka kenali, sementara yang lain memotong antara 5 dan 9 pasangan basa sebelum atau sesudahnya.

Biasanya enzim ini memotong pada ujung 5 'dari gugus fosfat, menimbulkan fragmen DNA dengan ujung 5' fosforil dan ujung hidroksil terminal 3 '.

Karena protein tidak bersentuhan langsung dengan tempat pengenalan dalam DNA, mereka harus ditranslokasi secara berurutan sampai situs tertentu tercapai, mungkin melalui mekanisme "geser" pada untai DNA.

Selama pembelahan enzimatik, ikatan fosfodiester dari setiap untai DNA ditempatkan di dalam salah satu situs aktif enzim restriksi. Ketika enzim meninggalkan situs pengenalan dan pembelahan, ia melakukannya melalui asosiasi transien non-spesifik.

Jenis

Lima jenis enzim restriksi saat ini dikenal. Berikut adalah uraian singkat masing-masing:

Enzim restriksi tipe I.

Enzim ini adalah protein pentamerik besar dengan tiga subunit, satu untuk restriksi, satu untuk metilasi, dan satu lagi untuk pengenalan urutan dalam DNA. Endonuklease ini adalah protein multifungsi yang mampu mengkatalis reaksi restriksi dan modifikasi, mereka memiliki aktivitas ATPase dan juga DNA topoisomerase.

Enzim jenis ini adalah endonuklease pertama yang ditemukan, mereka pertama kali dimurnikan pada tahun 1960-an dan telah dipelajari secara mendalam sejak saat itu.

Enzim tipe I tidak banyak digunakan sebagai alat bioteknologi, karena lokasi pembelahan dapat berada pada jarak variabel hingga 1.000 pasangan basa dari situs pengenalan, yang membuatnya tidak dapat diandalkan dalam hal reproduktifitas eksperimental.

Enzim restriksi tipe II

Mereka adalah enzim yang terdiri dari homodimer atau tetramer yang memotong DNA pada situs tertentu dengan panjang antara 4 dan 8 bp. Situs pembelahan ini biasanya palindromik, yaitu, mengenali urutan yang dibaca dengan cara yang sama di kedua arah.

Banyak dari enzim restriksi tipe II dalam bakteri memotong DNA ketika mereka mengenali karakter asingnya, karena tidak memiliki modifikasi khas yang seharusnya dimiliki DNA-nya sendiri.

Ini adalah enzim restriksi paling sederhana karena tidak memerlukan kofaktor selain magnesium (Mg +) untuk mengenali dan memotong urutan DNA.

Ketepatan enzim restriksi tipe II dalam mengenali dan memotong urutan sederhana dalam DNA pada posisi yang tepat menjadikannya salah satu yang paling banyak digunakan dan sangat diperlukan di sebagian besar cabang biologi molekuler.

Di dalam kelompok enzim restriksi tipe II terdapat beberapa subclass yang diklasifikasikan menurut sifat tertentu yang unik untuk masing-masing subkelas. Klasifikasi enzim tersebut dilakukan dengan menambahkan huruf alfabet, dari A sampai Z mengikuti nama enzim tersebut.

Beberapa subclass yang paling terkenal karena kegunaannya adalah:

Subclass IIA

Mereka adalah dimer dari subunit yang berbeda. Mereka mengenali urutan asimetris dan digunakan sebagai prekursor ideal untuk pembuatan enzim pemotongan.

Subkelas IIB

Mereka terdiri dari satu atau lebih dimer dan memotong DNA di kedua sisi urutan pengenalan. Mereka memotong kedua untai DNA dalam interval pasangan basa sebelum situs pengenalan.

Subclass IIC

Enzim jenis ini adalah polipeptida dengan fungsi pembelahan dan modifikasi untai DNA. Enzim ini memotong kedua untai secara asimetris.

Subkelas IIE

Enzim dari subclass ini adalah yang paling banyak digunakan dalam rekayasa genetika. Mereka memiliki situs katalitik dan umumnya membutuhkan efektor alosterik. Enzim ini perlu berinteraksi dengan dua salinan urutan pengenalannya untuk melakukan pembelahan yang efisien. Di dalam subkelas ini adalah enzim EcoRII dan EcoRI.

Enzim restriksi tipe III

Endonuklease restriksi tipe III hanya terdiri dari dua subunit, satu bertanggung jawab untuk pengenalan dan modifikasi DNA, sedangkan yang lain bertanggung jawab untuk pembelahan sekuens.

Enzim ini membutuhkan dua kofaktor untuk fungsinya: ATP dan magnesium. Enzim restriksi jenis ini memiliki dua situs pengenalan asimetris, mentranslokasi DNA dengan cara yang bergantung pada ATP dan memotongnya antara 20-30 bp yang berdekatan dengan lokasi pengenalan.

Enzim restriksi tipe IV

Enzim tipe IV mudah diidentifikasi karena mereka memotong DNA dengan tanda metilasi, mereka terdiri dari beberapa subunit berbeda yang bertanggung jawab untuk mengenali dan memotong urutan DNA. Enzim ini menggunakan GTP dan magnesium divalen sebagai kofaktor.

Situs pembelahan spesifik termasuk untai nukleotida dengan residu sitosin termetilasi atau terhidroksimetilasi pada satu atau kedua untai asam nukleat.

Enzim restriksi tipe V.

Klasifikasi ini mengelompokkan enzim tipe CRISPER-Cas, yang mengidentifikasi dan memotong urutan DNA spesifik dari organisme yang menyerang. Enzim Cas menggunakan untaian RNA pemandu yang disintesis CRISPER untuk mengenali dan menyerang organisme yang menyerang.

Enzim yang diklasifikasikan sebagai tipe V adalah polipeptida yang terstruktur oleh enzim tipe I, II dan II. Mereka dapat memotong bagian DNA dari hampir semua organisme dan dengan rentang panjang yang lebar. Fleksibilitas dan kemudahan penggunaannya menjadikan enzim ini salah satu alat yang paling banyak digunakan dalam rekayasa genetika saat ini, bersama dengan enzim tipe II.

Contoh

Enzim restriksi telah digunakan untuk mendeteksi polimorfisme DNA, terutama pada studi genetik populasi dan studi evolusioner yang menggunakan DNA mitokondria, guna memperoleh informasi tentang laju substitusi nukleotida.

Saat ini, vektor yang digunakan untuk transformasi bakteri untuk berbagai tujuan memiliki situs multiklon di mana situs pengenalan untuk beberapa enzim restriksi ditemukan.

Di antara enzim-enzim ini yang paling populer adalah EcoRI, II, III, IV dan V, diperoleh dan dijelaskan untuk pertama kali dari E. coli; HindIII dari H. influenzae dan BamHI dari B. amyloliquefaciens.

Referensi

1. Bickle, TA, & Kruger, DH (1993). Biologi Pembatasan DNA. Ulasan Mikrobiologi, 57 (2), 434–450.
2. Boyaval, P., Moineau, S., Romero, DA, & Horvath, P. (2007). CRISPR Memberikan resistensi yang didapat terhadap virus di prokariota. Science, 315 (Maret), 1709–1713.
3. Goodsell, D. (2002). Perspektif molekuler: Restriksi Endonuklease. Stem Cells Fundamentals of Cancer Medicine, 20, 190–191.
4. Halford, SE (2001). Melompat, melompat, dan berputar dengan enzim restriksi. Transaksi Masyarakat Biokimia, 29, 363-373.
5. Jeltsch, A. (2003). Pemeliharaan identitas spesies dan pengendalian spesiasi bakteri: fungsi baru untuk sistem pembatasan / modifikasi? Gene, 317, 13-16.
6. Krebs, J., Goldstein, E., & Kilpatrick, S. (2018). Lewin's Genes XII (edisi ke-12). Burlington, Massachusetts: Pembelajaran Jones & Bartlett.
7. Li, Y., Pan, S., Zhang, Y., Ren, M., Feng, M., Peng, N.,… She, Q. (2015). Memanfaatkan sistem Tipe I dan Tipe III CRISPR-Cas untuk pengeditan genom. Penelitian Asam Nukleat, 1-12.
8. Loenen, WAM, Dryden, DTF, Raleigh, EA, & Wilson, GG (2013). Enzim restriksi tipe I dan kerabatnya. Penelitian Asam Nukleat, 1–25.
9. Nathans, D., & Smith, HO (1975). Restriksi Endonuklease dalam analisis dan restrukturisasi molekul DNA. Annu. Pdt. Biochem. , 273–293.
10. Nei, M., & Tajima, F. (1981). Polimorfisme DNA dapat dideteksi dengan restriksi endonuklease. Genetika, 145-163.
11. Pingoud, A., Fuxreiter, M., Pingoud, V., & Wende, W. (2005). Pembatasan Endonuklease Jenis II Ilmu Kehidupan Seluler dan Molekuler: struktur dan mekanisme. Ilmu Kehidupan Seluler dan Molekuler CMLS, 62, 685-707.
12. Roberts, R. (2005). Bagaimana enzim restriksi menjadi tenaga kerja biologi molekuler. PNAS, 102 (17), 5905–5908.
13. Roberts, RJ, & Murray, K. (1976). Batasan endonuklease. Ulasan Kritis dalam Biokimia, (November), 123-164.
14. Stoddard, BL (2005). Struktur dan fungsi endonuklease homing. Ulasan Triwulanan Biofisika, 1–47.
15. Tock, MR, & Dryden, DTF (2005). Biologi pembatasan dan anti-pembatasan. Opini Saat Ini dalam Mikrobiologi, 8, 466–472. https://doi.org/10.1016/j.mib.2005.06.003
16. Wilson, GG, & Murray, NE (1991). Sistem Pembatasan dan Modifikasi. Annu. Rev. Genet. , 25, 585-627.
17. Wu, Z., & Mou, K. (2016). Wawasan genom ke virulensi Campylobacter jejuni dan genetika populasi. Infec. Dis. Terjemahan. Med., 2 (3), 109–119.
18. Yuan, R. (1981). Struktur dan Mekanisme Endonuklease Pembatasan Multifungsi. Annu. Pdt. Biochem. , 50, 285-315.