DAPI (4 ', 6-DIAMIDINO-2-PHENYLINDOLE): KARAKTERISTIK, ALASAN, PENGGUNAAN - KIMIA - 2025

The DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole) adalah pewarna oleh properti fluorescent berfungsi sebagai sebuah penanda, banyak digunakan dalam seni mikroskop fluoresensi atau cytometry mengalir, antara lain. Fluoresensi yang dipancarkannya berwarna biru cerah, eksitasi terjadi antara 455-461 nm (sinar UV).

Pewarna DAPI dapat melewati membran sel sel mati dengan sangat mudah. Itu juga dapat menodai inti sel hidup, tetapi dalam hal ini, konsentrasinya harus lebih tinggi.

Struktur kimia pewarna fluoresen DAPI. Sumber: Gambar: File: DAPI.svg adalah versi vektor dari file ini. Ini harus digunakan sebagai pengganti gambar raster ini jika gambar yang diedit tidak inferior / Richard Wheeler (Zephyris)

Pewarna mampu mengakses DNA seluler yang memiliki afinitas khusus, mengikat dengan sangat antusias pada basa nitrogen adenin dan timin. Untuk alasan ini sangat berguna dalam beberapa teknik biologi molekuler.

Senyawa ini termasuk dalam kelompok pewarna indol dan telah terbukti memiliki kepekaan yang lebih besar terhadap DNA dibandingkan etidium bromida dan propidium iodida, terutama pada gel agarosa.

Penggunaan pewarna fluoresen ini sangat luas, karena berguna untuk: mempelajari perubahan DNA dalam proses apoptosis (kematian sel) dan karena itu mendeteksi sel dalam proses ini; untuk foto jejak DNA (pencetakan foto DNA); untuk mempelajari kontaminasi bakteri; atau untuk memvisualisasikan segmentasi nuklir.

Ini juga telah digunakan dalam studi pita kromosom, dalam mendeteksi DNA Mycoplasmas sp, dalam interaksi DNA-protein, dalam pewarnaan dan penghitungan sel dengan imunofluoresensi dan bahkan untuk mewarnai butir serbuk sari yang matang.

karakteristik

DAPI adalah singkatan dari nama kimianya (4 ', 6-diamidino-2-phenylindole). Rumus molekulnya adalah C ₁₆ H ₁₅ N _5. Memiliki berat molekul 350,3. Di dekat rentang sinar UV (345 hingga 358 nm) eksitasi maksimum kompleks DAPI-DNA terjadi, sedangkan emisi fluoresensi maksimum terjadi antara 455-461 nm.

Pewarna ini bercirikan bubuk kuning, tetapi struktur yang ditandai dengan fluorofor ini memancarkan cahaya biru yang cemerlang.

Ini adalah senyawa yang larut dalam air, namun, untuk mempercepat pelarutannya beberapa panas dapat diterapkan. Ini dapat diencerkan dengan PBS tetapi tidak langsung dilarutkan di dalamnya.

Setelah pewarna disiapkan, pewarna harus disimpan dalam gelap, terlindung dari cahaya, pada suhu 2 hingga 8 ° C (lemari es). Dalam kondisi ini, pewarna stabil selama lebih dari 3 minggu atau bulan.

Jika terlindung dari cahaya tetapi dibiarkan pada suhu kamar, kestabilannya turun menjadi 2 atau 3 minggu, tetapi terkena cahaya langsung kerusakannya sangat cepat. Jika Anda ingin menyimpan lebih lama, dapat didinginkan pada suhu -20 ° C didistribusikan dalam alikuot.

Dasar

Pewarnaan ini didasarkan pada menghasilkan counterstain inti dalam teknik biologi molekuler utama, seperti: sitometri aliran, mikroskop fluoresensi, dan pewarnaan kromosom metafase atau inti interfase, antara lain.

Teknik ini didasarkan pada afinitas besar pewarna terhadap basa nitrogen (adenin dan timin) yang terkandung dalam materi genetik (DNA) di alur minor. Sedangkan pada tingkat sitoplasma hanya menyisakan sedikit latar belakang.

Ketika pewarna fluoresen berikatan dengan daerah adenin dan timin DNA, fluoresensi meningkat secara signifikan (20 kali lebih banyak). Warna yang dipancarkannya biru cerah. Khususnya, tidak ada emisi fluoresensi saat mengikat pasangan basa GC (guanin-sitosin).

Penting untuk dicatat bahwa meskipun ia juga memiliki afinitas untuk RNA, itu tidak menimbulkan masalah, karena tingkat emisi energi tertinggi dari molekul ini terjadi pada panjang gelombang lain (500 nm), tidak seperti DNA, yang melakukannya pada 460 nm. Lebih lanjut, peningkatan fluoresensi yang pernah terikat dengan RNA hanya 20%.

DAPI lebih banyak digunakan untuk menodai sel mati (terfiksasi) daripada sel hidup, karena konsentrasi pewarna yang jauh lebih tinggi diperlukan untuk mewarnai sel yang terakhir, hal ini karena membran sel kurang permeabel terhadap DAPI saat masih hidup.

Pewarna DAPI dapat digunakan dalam kombinasi dengan fluorofor merah dan hijau untuk pengalaman multi-warna.

Menggunakan

DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindole) adalah fluorofor yang sangat baik dan oleh karena itu banyak digunakan dalam berbagai teknik dan untuk berbagai keperluan. Berikut ini penjelasan tentang penggunaan DAPI dalam teknik utama.

Arus sitometri

Para peneliti Gohde, Schumann dan Zante pada tahun 1978 adalah yang pertama menggunakan dan mengusulkan DAPI sebagai fluorofor dalam teknik sitometri aliran, yang sukses besar karena sensitivitasnya yang tinggi terhadap DNA dan intensitasnya yang tinggi dalam emisi fluoresensi.

Penggunaan DAPI dalam teknik ini memungkinkan studi tentang siklus sel, kuantifikasi sel dan pewarnaan sel hidup dan mati.

Meskipun ada pewarna lain, seperti etidium bromida, oksida Hoechst, oranye acridine dan propidium iodida, DAPI adalah salah satu yang paling banyak digunakan karena lebih mudah di-foto daripada yang disebutkan sebelumnya.

Untuk teknik ini diperlukan untuk memperbaiki sel, untuk ini, etanol absolut atau paraformaldehida 4% dapat digunakan. Sampel disentrifugasi dan supernatannya dibuang, selanjutnya sel dihidrasi dengan menambahkan 5 ml buffer PBS selama 15 menit.

Sementara waktu berlalu, siapkan pewarnaan DAPI dengan buffer pewarnaan (FOXP3 dari BioLegend) pada konsentrasi 3 µM.

Sentrifugasi sampel, buang supernatan, lalu tutup dengan 1 ml larutan DAPI selama 15 menit pada suhu kamar.

Ambil sampel ke flow cytometer dengan laser yang sesuai.

Aliran Mikrofluorometri

Teknik lain di mana DAPI digunakan adalah fluorometri aliran mikro bersama dengan fluorofor lain yang disebut mithramycin. Keduanya berguna untuk mengukur DNA kloroplas secara individual, tetapi DAPI paling cocok untuk mengukur partikel bakteriofag T4.

Hibridisasi

Teknik ini pada dasarnya menggunakan probe DNA yang diberi label pewarna fluoresen yang dapat berupa DAPI.

Sampel membutuhkan perlakuan panas untuk mengubah sifat DNA untai ganda dan mengubahnya menjadi dua untai tunggal. Ini kemudian dihibridisasi dengan probe DNA terdenaturasi berlabel DAPI yang memiliki urutan yang menarik.

Kemudian dicuci untuk menghilangkan apa yang tidak dihibridisasi, kontras digunakan untuk memvisualisasikan DNA. Mikroskop fluoresensi memungkinkan pengamatan probe hibridisasi.

Teknik ini bertujuan untuk mendeteksi urutan tertentu dalam DNA kromosom, mampu mendiagnosis penyakit tertentu.

Teknik sito-molekuler ini sangat membantu dalam menentukan detail dalam studi kariotipe. Misalnya, dia telah menunjukkan daerah kaya pasangan basa adenosin dan timin yang disebut daerah heterokromatik atau pita DAPI.

Teknik ini banyak digunakan untuk mempelajari kromosom dan kromatin pada tumbuhan dan hewan, serta dalam diagnosis patologi prenatal dan hematologi pada manusia.

Pada teknik ini, konsentrasi DAPI yang direkomendasikan adalah 150 ng / ml selama 15 menit.

Slide yang dirakit harus disimpan terlindung dari cahaya pada suhu 2-8 ° C.

Pewarnaan imunofluoresensi

Sel difiksasi dengan paraformaldehyde 4%. Jika noda lain akan digunakan, DAPI dibiarkan di ujung sebagai counterstain dan sel ditutup dengan larutan PBS selama 15 menit. Sementara waktu berlalu, persiapkan larutan DAPI dengan cara diencerkan dengan PBS sehingga konsentrasi akhir adalah 300 µM.

Kemudian kelebihan PBS dibuang dan ditutup dengan DAPI selama 5 menit. Mencuci beberapa kali. Slide dilihat di bawah mikroskop fluoresensi di bawah filter yang sesuai.

Lembar pengaman

Senyawa ini harus ditangani dengan hati-hati, karena merupakan senyawa yang memiliki sifat mutagenik. Karbon aktif digunakan untuk menghilangkan senyawa ini dari larutan encer yang akan dibuang.

Sarung tangan, gaun pelindung dan kacamata pengaman harus digunakan untuk menghindari kecelakaan dengan reagen ini. Jika terjadi kontak dengan kulit atau mukosa, area tersebut harus dicuci dengan air yang cukup.

Anda tidak boleh memipet reagen ini melalui mulut, gunakan pipet.

Jangan mencemari reagen dengan agen mikroba karena akan menyebabkan hasil yang salah.

Jangan mengencerkan noda DAPI lebih dari yang disarankan, karena akan sangat menurunkan kualitas noda.

Jangan paparkan reagen ke cahaya langsung, atau tetap hangat karena ini mengurangi fluoresensi.

Referensi

1. Brammer S, Toniazzo C dan Poersch L. Corantes umumnya terlibat dalam sitogenetik tanaman. Arq. Inst. Biol. 2015, 82. Tersedia dari: scielo.
2. Laboratorium Impath. DAPI. Tersedia di: menarinidiagnostics.com/
3. Laboratorium Cytocell. 2019. Petunjuk penggunaan DAPI. tersedia di cytocell.com
4. Elosegi A, Sabater S. Konsep dan teknik dalam ekologi sungai. (2009). Editorial Rubes, Spanyol. Tersedia di: books.google.co.ve/
5. Novaes R, Penitente A, Talvani A, Natali A, Neves C, Maldonado I. Penggunaan fluoresensi dalam metode disektor yang dimodifikasi untuk memperkirakan jumlah miosit dalam jaringan jantung. Arch. Bras. Cardiol. 2012; 98 (3): 252-258. Tersedia dari: scielo.
6. Rojas-Martínez R, Zavaleta-Mejía E, Rivas-Valencia P. Adanya fitoplasma pada pepaya (Carica papaya) di Meksiko. Majalah Chapingo. Seri hortikultura, 2011; 17 (1), 47-50. Tersedia di: scielo.org.