PEWARNAAN SPORA: ALASAN, TEKNIK DAN PENGGUNAAN - BIOLOGI - 2025

The spora pewarnaan adalah metodologi yang digunakan untuk mewarnai struktur perlawanan yang membentuk beberapa genera bakteri ketika dalam kondisi yang tidak menguntungkan; Struktur ini sesuai dengan bentuk kelangsungan hidup.

Ada banyak genera yang membentuk spora; Namun, yang utama adalah Bacillus dan Clostridium. Genera ini dianggap lebih relevan karena memiliki spesies patogen bagi manusia.

Pewarnaan spora dengan metode Shaeffer - Fulton atau Wirtz-Conklin. Dan tambe (pengunggah asli), dari Wikimedia Commons

Setiap basil dapat menghasilkan spora. Pada saat pewarnaan sediaan, spora dapat ditemukan di dalam basil (endospora) atau di luarnya (eksospora). Dengan teknik pewarnaan konvensional untuk bakteri - seperti pewarnaan Gram - spora tetap tidak berwarna.

Saat ini, terdapat beberapa metodologi pewarnaan yang mampu menembus struktur tebal spora untuk diwarnai. Metodologi ini sangat bervariasi; Ini termasuk teknik Dorner, noda Möeller dan metodologi Shaeffer - Fulton, juga dikenal sebagai Wirtz-Conklin.

Dari semua teknik yang disebutkan, metodologi Shaeffer-Fulton adalah yang paling banyak digunakan di laboratorium rutin. Ini dinamai dua ahli mikrobiologi yang menciptakan pewarnaan pada tahun 1930: Alicia Shaeffer dan MacDonald Fulton. Namun, teknik ini kadang-kadang dinamai Wirtz-Conklin, diambil dari nama dua ahli bakteriologi dari tahun 1900-an.

Dasar

Spora tidak ternoda dengan noda konvensional karena memiliki dinding yang sangat tebal. Komposisi kompleks spora mencegah masuknya sebagian besar pewarna.

Jika spora dipelajari dari luar ke dalam, maka akan diamati lapisan-lapisan berikut: pertama, eksosporium, yaitu lapisan tertipis dan terluar yang dibentuk oleh glikoprotein.

Berikutnya adalah kutikula, yang memberikan ketahanan terhadap suhu tinggi, diikuti oleh korteks yang terdiri dari peptidoglikan. Nanti adalah dinding alas yang melindungi protoplas.

Spora adalah struktur dehidrasi yang mengandung 15% kalsium dan asam dipicolinic. Oleh karena itu, sebagian besar teknik pewarnaan spora bergantung pada penerapan panas sehingga pewarna dapat menembus struktur yang tebal.

Setelah ternoda, spora tidak dapat menghilangkan pewarna. Dalam teknik Shaeffer - Fulton, hijau perunggu memasuki sel vegetatif dan, ketika panas diterapkan, menembus endospora serta eksospora.

Dengan mencuci dengan air, pewarna dikeluarkan dari sel vegetatif. Hal ini terjadi karena pewarna hijau perunggu agak basa, sehingga mengikat lemah ke sel vegetatif.

Sebaliknya, ia tidak bisa keluar dari spora dan akhirnya basil diwarnai dengan safranin. Landasan ini berlaku untuk teknik lainnya, di mana hal serupa terjadi.

Teknik pewarnaan spora

Untuk melakukan pewarnaan spora, kultur murni dari strain yang mencurigakan yang akan dipelajari harus diperoleh.

Kultur dikenakan suhu ekstrim selama 24 jam untuk merangsang mikroorganisme berspora. Untuk ini, kultur dapat ditempatkan dalam oven pada suhu 44 ° C atau di lemari es (8 ° C) selama 24 atau 48 jam.

Jika dibiarkan terlalu lama pada suhu tersebut, hanya eksospora yang akan diamati, karena semua endospora sudah keluar dari basil.

Di akhir waktu, beberapa tetes larutan fisiologis steril harus ditempatkan pada kaca objek yang bersih. Kemudian sebagian kecil dari budaya diambil dan disebarkan dengan baik.

Setelah itu, dibiarkan mengering, dipanaskan dan diwarnai dengan salah satu teknik yang dijelaskan di bawah ini:

Teknik Dorner

1- Siapkan dalam tabung reaksi suspensi pekat dari mikroorganisme bersporulasi dalam air suling dan tambahkan volume yang sama dari karbol fuchsin Kinyoun yang telah disaring.

2- Tempatkan tabung di bak mandi dengan air mendidih selama antara 5 dan 10 menit.

3- Pada kaca objek bersih, campurkan setetes suspensi sebelumnya dengan setetes larutan nigrosine 10% encer, rebus dan saring.

4- Sebarkan dan keringkan dengan cepat dengan api kecil.

5- Periksa dengan tujuan 100X (pencelupan).

Spora berwarna merah dan sel bakteri tampak hampir tidak berwarna dengan latar belakang abu-abu tua.

Teknik Dorner yang Dimodifikasi

1- Suspensi mikroorganisme bersporulasi disebarkan pada kaca objek dan difiksasi dalam panas.

2- Sampel ditutup dengan strip kertas saring yang ditambahkan carbol fuchsin. Pewarna dipanaskan selama 5 sampai 7 menit dengan nyala api pembakar Bunsen sampai terbentuk uap air. Kemudian kertasnya dilepas.

3- Sediaan dicuci dengan air kemudian dikeringkan dengan kertas penyerap.

4- Tutupi apusan dengan film tipis 10% nigrosin, gunakan kaca objek kedua untuk menyebarkan nigrosin atau jarum.

Pewarnaan yang diambil oleh spora dan bakteri sama dengan yang dijelaskan pada penemuan sebelumnya.

Shaeffer - Teknik Fulton atau Wirtz-Conklin

1- Buat olesan halus dengan suspensi mikroorganisme bersporulasi pada slide dan tempelkan ke panas.

2- Tutupi slide dengan larutan air hijau malachite 5% (Anda dapat meletakkan kertas saring pada slide).

3- Panaskan di atas api pembakar Bunsen untuk melepaskan uap dan menghilangkan nyala api. Ulangi operasi ini selama 6 hingga 10 menit. Jika larutan malachite green menguap terlalu banyak selama prosedur, lebih banyak dapat ditambahkan.

4- Keluarkan kertas saring (jika dipasang) dan cuci dengan air.

5- Tutup slide dengan safranin encer 0,5% selama 30 detik (beberapa varian teknik menggunakan safranin berair 0,1% dan biarkan selama 3 menit).

Dengan teknik ini, spora tampak hijau dan basil berwarna merah.

Kerugiannya adalah endospora kultur muda tidak ternoda dengan baik, karena tampak sangat bening atau tidak berwarna. Untuk menghindari hal ini, dianjurkan untuk menggunakan kultur inkubasi selama 48 jam.

Teknik Möeller

1- Tutupi noda dengan kloroform selama 2 menit.

2- Buang kloroform.

3- Tutup dengan asam kromat 5% selama 5 menit.

4- Cuci dengan air suling

5- Lembarannya ditutup dengan karbol fuchsin-fenicada dan disinari api pembakar Bunsen sampai keluarnya uap; kemudian dikeluarkan dari nyala api selama beberapa saat. Operasi diulangi sampai 10 menit selesai.

6- Cuci dengan air.

7- Gunakan etanol yang diasamkan (alkohol hidroklorik) untuk mengubah warna. Itu dibiarkan selama 20 atau 30 detik.

8- Cuci dengan air suling.

9- Kontraskan dengan menutupi lembaran dengan biru metilen selama 5 menit.

10- Cuci dengan air suling.

11- Biarkan mengering dan sampel dibawa ke mikroskop.

Spora tampak merah dan basil berwarna biru. Penting untuk tidak menghirup uapnya, karena beracun dan dalam jangka panjang dapat menyebabkan kanker.

Teknik Möeller yang dimodifikasi tanpa panas

Pada tahun 2007 Hayama dan kolaboratornya membuat modifikasi teknik Möeller. Mereka menghilangkan langkah pemanasan pewarna dan menggantinya dengan menambahkan 2 tetes surfaktan Tergitol 7 untuk setiap 10 ml larutan karbol fuchsin-carbol. Hasil yang sama diperoleh.

Aplikasi

Pewarnaan spora memberikan informasi yang sangat berharga dan berguna untuk identifikasi patogen, karena keberadaannya, bentuknya, lokasinya di dalam basil dan kemampuan untuk merusak sel vegetatif atau tidak, merupakan data yang dapat memandu spesies. terlibat dalam genre tertentu.

Dalam konteks ini, perlu dikatakan bahwa spora bisa berbentuk bulat atau oval, mereka bisa berada di tengah atau juga di posisi paracentral, subminal atau terminal.

Diagram bentuk dan posisi endospora dan eksospora

Contoh

- Clostridium difficile membentuk spora oval dalam posisi terminal yang merusak basil.

- Spora Clostridium tertium berbentuk oval, tidak merusak bentuk basil dan terletak di tingkat terminal.

- Endospora dari Clostridium tetani bersifat terminal dan merusak bentuk basil, memberikan tampilan seperti stik drum.

- Spora Clostridium botulinum, C. histolyticum, C. novy dan C. septicum berbentuk bulat atau oval subterminal dan merusak bentuk basil.

- Endospora Clostridium sordelli terletak di posisi tengah, dengan sedikit deformasi.

Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnosis Mikrobiologis. (Edisi ke-5). Argentina, Editorial Panamericana SA

Referensi

1. Hayama M, Oana K, Kozakai T, Umeda S, Fujimoto J, Ota H, Kawakami Y. Proposal teknik yang disederhanakan untuk pewarnaan spora bakteri tanpa menerapkan modifikasi metode Moeller yang berhasil dengan panas. Eur J Med Res.2007; 16 12 (8): 356-9.
2. Kontributor Wikipedia. Noda Moeller. Wikipedia, ensiklopedia gratis. 3 November 2018, 03:28 UTC. Tersedia di: en.wikipedia.org
3. Pérez R, Juárez M, Rodríguez (2011). Manual Laboratorium Teknik Mikrobiologi. Jurusan Akademi Ilmu Pengetahuan Dasar Mikrobiologi. Institut Politeknik Nasional.
4. "Endospora." Wikipedia, ensiklopedia gratis. 25 Feb 2018, 10:20 UTC. 10 Jan 2019, 02:42: en.wikipedia.org
5. Silva L, Silva C, Fernández N, Bueno C, Torres J, Rico M, Macías J dan kolaborator. (2006). Tenaga Kerja dari komunitas otonom Extremadura. Agenda Khusus Volume IV. Editorial MAD. Seville-Spanyol, hlm 211-212.
6. Silva M, García M, Corrales J, Ponce E. (2006). Teknisi laboratorium spesialis, Galician Health Service (SERGAS). Mata kuliah khusus volume 2. Editorial MAD. Seville-Spanyol, hlm 79-80.
7. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnosis Mikrobiologis. (Edisi ke-5). Argentina, Editorial Panamericana SA
8. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. 2009. Diagnosis Mikrobiologis Bailey & Scott. 12 ed. Argentina. Editorial Panamericana SA