KALDU UREA: ALAS BEDAK, PERSIAPAN DAN PENGGUNAAN - BIOLOGI - 2024

The urea broth merupakan media kultur cair, digunakan untuk mendeteksi keberadaan enzim urease dalam mikroorganisme tertentu. Urease adalah enzim mikroba yang diproduksi secara konstitutif, yaitu disintesis terlepas dari ada atau tidaknya substrat tempat kerjanya.

Fungsi urease berkaitan dengan dekomposisi senyawa organik. Tidak semua mikroorganisme mampu mensintesis enzim ini, oleh karena itu penentuannya di laboratorium memungkinkan untuk mengidentifikasi strain bakteri tertentu dan bahkan membedakan spesies dari genus yang sama.

Tes urea negatif dan positif. Sumber: Foto diambil oleh penulis MSc. Marielsa Gil.

Ada dua jenis tes urea: Stuart dan Christensen. Mereka berbeda dalam komposisi dan kepekaan. Yang pertama khusus untuk menunjukkan sejumlah besar urease yang diproduksi oleh spesies dari genus Proteus.

Yang kedua lebih sensitif dan dapat mendeteksi sejumlah kecil urease yang dihasilkan terlambat oleh genera bakteri lain, seperti Klebsiella, Enterobacter, Staphylococcus, Brucella, Bordetella, Bacillus, Micrococcus, Helicobacter dan Mycobacterium.

Kaldu Urea Stuart terdiri dari Urea, Sodium Chloride, Dipotassium Phosphate, Monopotassium Phosphate, Yeast Extract, Phenol Red, dan Distilled Water.

Sedangkan kaldu atau agar urea Christensen terdiri dari pepton, natrium klorida, monopotasium fosfat, glukosa, urea, merah fenol, air suling, dan agar-agar. Yang terakhir hanya jika itu adalah media padat.

Dasar

Enzim urease menghidrolisis urea untuk membentuk karbon dioksida, air, dan dua molekul amonia. Senyawa ini bereaksi membentuk produk akhir yang disebut amonium karbonat.

Kaldu Urea Stuart

Kaldu urea Stuart lebih tersangga dengan pH 6,8. Oleh karena itu, mikroorganisme harus mampu membentuk amonia dalam jumlah besar untuk mengubah fenol menjadi merah. PH harus naik di atas 8.

Oleh karena itu, kaldu urea Stuart selektif untuk spesies Proteus, memberikan hasil positif dalam 24 hingga 48 jam inkubasi, dan tidak efektif untuk bakteri yang menghasilkan urease dalam jumlah rendah atau yang perlahan menghidrolisis urea.

Ini karena spesies Proteus dapat menggunakan urea sebagai sumber nitrogen. Sebaliknya, bakteri penghasil urease lain membutuhkan sumber tambahan.

Namun, Pérez et al. (2002) menetapkan bahwa kaldu urea Stuart seefisien agar urea Christensen untuk menentukan urease dalam strain ragi dari genera Candida, Cryptococcus, Rhodotorula, Trichosporon dan Saccharomyces.

Penulis penelitian mengklaim telah mencapai 100% kesepakatan dengan kedua media (Stuart dan Christensen) saat inkubasi selama 24 dan 48 jam; dengan pengecualian bahwa strain yang berhasil mengubah media menjadi warna pinkish-fuchsia yang kuat dianggap positif.

Klarifikasi ini diperlukan, karena Lodder (1970) menyatakan bahwa hampir semua khamir berhasil mengubah bevel agar Christensen urea menjadi merah muda pucat. Hal ini disebabkan fakta bahwa mereka dapat menghidrolisis urea dalam jumlah minimal, dan pembentukan amina melalui dekarboksilasi oksidatif asam amino di permukaan. Ini tidak boleh ditafsirkan sebagai positif.

Agar Urea atau Kaldu Christensen

Kaldu atau agar urea Christensen kurang buffer, mampu mendeteksi sejumlah kecil amonia. Selanjutnya media ini diperkaya dengan pepton dan glukosa. Senyawa ini menyebabkan tumbuhnya mikroorganisme penghasil urease lain yang tidak tumbuh di kaldu Stuart.

Demikian juga, tes urea Christensen menawarkan hasil yang lebih cepat, terutama untuk Proteus, mampu memberikan hasil yang sangat positif hanya dalam 30 menit sebagai waktu minimum dan hingga 6 jam sebagai waktu maksimum.

Mikroorganisme penghasil urease lainnya berhasil mengubah warna medium sedikit setelah 6 jam, dan kuat setelah 24, 48, 72 jam atau lebih, dan bahkan beberapa strain dapat memberikan reaksi lemah setelah 5 atau 6 hari.

Interpretasi dari kedua media (Stuart dan Christensen)

Media awalnya berwarna kuning-oranye dan reaksi positif akan mengubah warna media menjadi merah muda-fuchsia. Intensitas warna berbanding lurus dengan jumlah amonia yang dihasilkan.

Reaksi negatif akan meninggalkan warna media asli dengan pengecualian ragi, yang dapat berubah menjadi merah muda pucat pada media agar urea Christensen.

Persiapan

Kaldu Urea Stuart

Timbang gram yang diperlukan sesuai dengan indikasi perusahaan komersial. Larutkan dalam air suling yang lebih disukai steril. Jangan gunakan panas untuk melarutkan, karena urea sensitif terhadap panas.

Filtrasi membran digunakan untuk mensterilkan. Untuk ini, filter Millipore dengan pori-pori berdiameter 0,45 µ digunakan. Jangan gunakan autoclave. Setelah larutan disaring, itu didistribusikan ke dalam tabung steril. Untuk mendapatkan hasil yang andal, harus dipindahkan antara 1,5 ml sebagai jumlah minimum dan 3 ml sebagai jumlah maksimum per tabung.

Simpan di lemari es dan hangatkan sebelum digunakan.

Jika metode filtrasi tidak tersedia, media harus segera digunakan untuk mendapatkan hasil yang andal.

Cara lain untuk menyiapkan Kaldu Urea Stuart adalah sebagai berikut:

Beberapa rumah komersial menjual media dasar untuk uji urea, tidak termasuk urea.

Kuantitas yang ditunjukkan oleh perusahaan komersial ditimbang. Ini dilarutkan dalam air suling dan disterilkan dalam autoklaf pada 121 ° C selama 15 menit. Diamkan sedikit dan bila medianya hangat, tambahkan 100 ml larutan urea yang disiapkan pada 20% dan disterilkan dengan filtrasi.

Itu didistribusikan dalam tabung steril, seperti yang dijelaskan sebelumnya.

Agar Urea atau Kaldu Christensen

-Persiapan larutan urea

Timbang 29 g urea kering dan larutkan dalam 100 ml air suling. Gunakan metode filtrasi untuk mensterilkan. Jangan autoclave.

-Urea base agar

Larutkan 24 g agar basa dehidrasi dalam 950 ml air suling. Sterilkan dalam autoclave pada 121 ° C selama 15 menit. Biarkan istirahat hingga mencapai suhu 50 ° C dan tambahkan urea yang telah disiapkan sebelumnya secara aseptik.

Tuang 4-5 ml ke dalam tabung steril dan miringkan hingga padat. Harus ada paruh seruling yang panjang.

Media ini juga bisa dibuat dalam bentuk cair.

Aplikasi

Tes urea sangat efektif dalam membedakan genus Proteus dari genera lain dalam Famili Enterobacteriaceae, mengingat reaksi cepat yang diberikan oleh Proteus.

Dengan menggunakan komposisi Christensen, pengujian tersebut membantu membedakan antara spesies dari genus yang sama. Misalnya, S. haemolyticus dan S. warneri adalah Staphylococcus koagulase-negatif dan beta-hemolitik, tetapi berbeda pada S. haemolyticus adalah urea negatif dan S. warneri positif urea.

Di sisi lain, McNulty berhasil menggunakan kaldu urea 2% Christensen untuk mempelajari keberadaan Helicobacter pylori dalam sampel biopsi yang diambil dari mukosa lambung (daerah antral).

Keberadaan H. pylori dibuktikan dengan uji urea yang positif. Durasi waktu untuk mengamati hasil berbanding lurus dengan jumlah mikroorganisme yang ada.

Seperti yang dapat dilihat, ini adalah metode sederhana untuk mendiagnosis Helicobacter pylori dalam biopsi lambung.

Terakhir, tes ini juga berguna untuk membedakan spesies dari genera Brucella, Bordetella, Bacillus, Micrococcus, dan Mycobacteria.

Menabur uji urea

Kedua metode tersebut membutuhkan inokulum mikroba yang kuat untuk mengoptimalkan hasil. Koloni bakteri sebaiknya diambil dari agar darah dan ragi dari agar Sabouraud, dengan beberapa pengecualian. Inokulum diemulsi dalam media cair.

Untuk kaldu urea Stuart, inkubasi pada suhu 37 ºC selama 24 hingga 48 jam, dengan mengetahui bahwa Anda hanya mencari strain Proteus jika strainnya adalah bakteri. Untuk khamir, dapat diinkubasi pada suhu 37 ° C atau pada suhu kamar selama 24 hingga 48 jam inkubasi.

Untuk kaldu urea Christensen, diinkubasi pada suhu 37 ºC selama 24 jam. Jika hasil tes negatif, dapat diinkubasi hingga 6 hari. Jika tesnya positif sebelum 6 jam, itu menunjukkan bahwa itu adalah strain dari genus Proteus.

Dalam kasus agar urea Christensen, bevel agar-agar diinokulasi dengan kuat, tanpa menusuk. Kaldu diinkubasi dan diinterpretasikan dengan cara yang sama.

QA

Strain kontrol seperti Proteus mirabilis ATCC 43071, Klebsiella pneumoniae ATCC 7006003, Escherichia coli ATCC 25922 dan Salmonella typhimurium dapat digunakan untuk menguji media. Dua yang pertama harus memberikan hasil positif dan dua hasil negatif terakhir.

Sumber: Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnosis Mikrobiologis. Edisi ke-5. Editorial Panamericana SA Argentina.

Referensi

1. Pérez C, Goitía K., Mata S, Hartung C, Colella M, Reyes H. dkk. Penggunaan kaldu urea Stuart untuk uji urease, sebagai uji diagnosis ragi. Pendeta Soc. Ven. Mikrobiol. 2002; 22 (2): 136-140. Tersedia di: Scielo.org.
2. Mac Faddin J. (2003). Tes biokimia untuk identifikasi bakteri yang penting secara klinis. Edisi ke-3. Editorial Panamericana. Buenos Aires. Argentina.
3. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Diagnosis Mikrobiologis Bailey & Scott. 12 ed. Editorial Panamericana SA Argentina.
4. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnosis Mikrobiologis. Edisi ke-5. Editorial Panamericana SA Argentina.
5. Laboratorium Britannia. Christensen Medium (Urea agar base) 2015. Tersedia di: britanialab.com