BUFFER FOSFAT (PBS): ALASAN, PERSIAPAN DAN PENGGUNAAN - BIOLOGI - 2025

The penyangga fosfat, fosfat Buffered saline atau BPS merupakan penyangga isotonik, yang berfungsi untuk menjaga pH dan tekanan osmotik sebagai dekat dengan lingkungan biologis alami (fisiologis). Akronim PBS adalah singkatan dari fosfat buffered saline.

PH dan osmolaritas adalah dua aspek yang sangat penting yang harus dikontrol dalam protokol laboratorium tertentu. Dalam kasus pH, penting untuk mengontrolnya, terutama dalam reaksi biokimia, karena ini dapat bervariasi atau tidak dilakukan jika reaktan berada pada pH yang tidak sesuai.

PBS fosfat buffered saline pada dua pH yang berbeda. Sumber: Pixinio.com

Sementara itu, kontrol osmolaritas sangat penting terutama saat bekerja dengan sel hidup, karena membran plasma sel bereaksi sesuai dengan konsentrasi zat terlarut tempat mereka ditemukan.

Jika sel dipindahkan ke media hipertonik, sel akan mengalami dehidrasi, karena gradien air akan dipindahkan ke sisi di mana terdapat konsentrasi zat terlarut yang lebih tinggi. Sebaliknya, jika sel ditempatkan dalam medium hipotonik, sel akan menyerap cairan hingga larut.

Itulah mengapa buffer PBS digunakan untuk protokol laboratorium yang memerlukan pemeliharaan sel secara in vitro, dengan cara ini sel tidak akan rusak.

PBS terdiri dari kombinasi garam, seperti natrium klorida, natrium fosfat, kalium klorida, dan kalium fosfat. Komposisi PBS dapat bervariasi tergantung pada protokolnya.

Dasar

Pada dasarnya fungsi buffer fosfat adalah untuk menjaga pH fisiologis tetap konstan bersama dengan konsentrasi elektrolit yang serupa dengan yang ditemukan di dalam tubuh.

Dalam lingkungan ini, sel-sel dapat tetap stabil, karena kondisi fisiologis disimulasikan sebanyak mungkin.

Senyawa lain dapat ditambahkan pada formulasi PBS asli jika diperlukan, misalnya penambahan EDTA pada buffer berguna untuk mencuci sel darah merah pada uji ketidakcocokan silang.

EDTA mencegah fraksi komplemen C1 yang ada dalam serum untuk dibelah dan dilisiskan ke sel darah merah, yaitu menghindari hasil inkompatibilitas yang salah. Selain itu, EDTA membantu memisahkan sel.

Persiapan

Jumlah garam yang harus ditimbang untuk pembuatan larutan buffer fosfat PBS akan tergantung pada jumlah yang perlu disiapkan:

-Larutan stok saline buffer fosfat (10X PBS)

Untuk satu liter larutan:

Menimbang:

80,6 g NaCl,

2,2 g KCl,

11,5 g Na ₂ HPO ₄ ,

2.0 g KH ₂ HPO ₄

Teknik persiapan

Masukkan garam kental ke dalam gelas kimia, tambahkan air secukupnya (80%) dan aduk pada pelat pengaduk dengan batang magnet hingga garam larut.

Pembuatan PBS menggunakan pelat pengaduk dengan batang magnet. Sumber: Pengguna: Ruhrfisch, Wikipedia. com

Filter untuk menghilangkan partikel yang tidak larut. Gunakan filter dengan pori 0,45 µm. Autoklaf dan distribusikan secara aseptik dalam kap aliran laminar dalam toples kaca dengan tutup.

Larutan 10X (pekat) tidak menyesuaikan pH. Penyesuaian dilakukan setelah diencerkan dengan konsentrasi buffer PBS 1X, (pengenceran 1:10).

-Buffer fosfat saline (1X PBS)

1X PBS dapat disiapkan secara langsung, menimbang jumlah yang sesuai dari masing-masing garam, atau dapat dibuat dengan mengencerkan larutan stok (1:10) dengan air suling steril.

-Untuk menyiapkan langsung satu liter 1X PBS buffered saline fosfat, timbang:

8,06 g NaCl,

0,22 g KCl,

1,15 g Na ₂ HPO ₄ ,

0,20 g KH ₂ HPO ₄

Teknik persiapan

Lanjutkan seperti yang dijelaskan dalam larutan pekat. Selanjutnya pH harus disesuaikan. Untuk melakukan ini, ukur pH dan tergantung pada hasilnya, gunakan asam (HCl) atau basa (NaOH) untuk menurunkan atau menaikkan pH masing-masing sesuai kebutuhan, hingga menjadi 7,4.

Asam atau basa ditambahkan setetes demi setetes sambil memantau nilai pH larutan menggunakan pengukur pH. Filter, autoclave, dan distribusikan secara aseptik ke dalam tabung atau toples berbentuk kerucut sesuai kebutuhan.

-Untuk menyiapkan 1X PBS dari larutan stok 10X:

Buat pengenceran 1:10. Misalnya, untuk menyiapkan 1 liter 1X PBS, ukur 100 ml larutan stok dan tambahkan 700 ml akuades steril. Sesuaikan pH dan isi jumlah air hingga 1000 ml.

Buffer PBS yang disiapkan tidak berwarna dan jernih.

PBS harian dapat disimpan pada suhu kamar dan sisanya di lemari es.

Solusi untuk penyesuaian pH

HCl

Untuk 100 ml HCL 1 molar (asam klorida).

Takar 91 mL air suling dan masukkan ke dalam gelas kimia 250 mL.

Takar 8,62 mL HCl pekat dan tambahkan perlahan ke dalam gelas kimia berisi air (jangan lakukan sebaliknya). Lakukan tindakan biosafety yang tepat saat menangani asam kuat (zat yang sangat korosif).

Campur selama 5 menit sebaiknya menggunakan pelat pengaduk dengan batang magnet di dalam gelas. Pindahkan ke dalam labu 100 ml dan isi hingga 100 ml dengan H ₂ O suling.

NaOH

Untuk 100 ml NaOH (natrium hidroksida) 10 molar.

Takar 40 mL air suling dan masukkan ke dalam gelas kimia 250 mL. Ukur 40 g NaOH dan tambahkan ke air. Campur menggunakan pelat pengaduk dengan batang magnet di dalam gelas.

Pindahkan ke labu ukur 100 ml dan ratakan dengan air suling. Patuhi peraturan keamanan hayati, karena reaksi ini eksotermik (melepaskan energi dalam bentuk panas).

Jika Anda ingin menyiapkan larutan garam fosfat dalam jumlah lain, Anda dapat melihat tabel berikut:

Sumber: «Laboratorium Viral dan Genomik Manusia, Fakultas Kedokteran UASLP»

Aplikasi

Ini terutama digunakan dalam biologi sel, imunologi, imunohistokimia, bakteriologi, virologi, dan laboratorium penelitian.

Ini sangat ideal untuk pencucian sel dengan sentrifugasi (sel darah merah), pencucian lapisan tunggal sel, dalam teknik elipsometri spektroskopi, dalam kuantifikasi biofilm bakteri, dalam pemeliharaan kultur sel untuk virus, sebagai larutan pencuci dalam teknik imunofluoresensi tidak langsung dan dalam teknik karakterisasi antibodi monoklonal.

Ini juga digunakan untuk mengangkut sel atau jaringan, sebagai pengencer untuk penghitungan sel, persiapan enzim seluler (tripsin), sebagai pengencer untuk metode pengeringan biomolekul dan untuk menyiapkan reagen lainnya.

Di sisi lain, Martin et al. Pada tahun 2006 menunjukkan bahwa PBS berguna di laboratorium ilmu forensik, khususnya dalam pemulihan sperma dari apusan vagina, atau dalam pemulihan sel-sel vagina dari apusan penis. Dengan cara ini bisa ditentukan jika telah terjadi hubungan seksual.

Batasan

-Beberapa buffer PBS mengandung zat yang disebut natrium azida sebagai pengawet. Senyawa ini dapat menghasilkan bahan peledak jika bersentuhan dengan timbal atau tembaga. Untuk alasan ini, perhatian khusus harus diberikan saat membuang reagen ini ke saluran pembuangan. Jika dibuang dengan cara ini, air yang melimpah harus ditambahkan untuk mengencerkannya secara maksimal.

-Zinc tidak boleh ditambahkan ke buffer fosfat, karena menyebabkan beberapa garam mengendap.

-Wangen dan kolaborator pada tahun 2018 menetapkan bahwa penggunaan PBS tidak sesuai untuk mencuci sel primer leukemia myeloid akut (AML) yang diekstraksi dari darah tepi, karena banyak sel yang hilang oleh lisis, dengan penurunan material yang besar. protein.

Oleh karena itu, mereka menentukan bahwa sel AML primer tidak boleh dicuci dengan PBS setelah disimpan dalam nitrogen cair.

Referensi

1. Coll J. (1993). Teknik diagnostik dalam virologi. Ed Díaz de Santos. 360 pg
2. Rodríguez M, Ortiz T. Kultur sel. Perubahan Media. Departemen Sitologi dan Histologi Normal dan Patologi University of Seville. Tersedia di personal.us.es
3. Pembuatan Phosphate Buffered Saline (PBS). (2008). Prosedur Operasi Standar (SOP) Laboratorium Genomik Manusia dan Virus Fakultas Kedokteran UASLP. Tersedia di: genomica.uaslp.mx
4. "Saline Penyangga Fosfat." Wikipedia, ensiklopedia gratis. 3 Apr 2019, 19:36 UTC. 13 Apr 2019, 02:57 en.wikipedia.org.
5. Pietrasanta L, Von-Bilderling C. Topik dalam biofisika molekuler. Tersedia di: users.df.uba.ar
6. Rediar. Manual. PBS + EDTA. Tersedia di: felsan.com.ar
7. Martin NC, Pirie AA, Ford LV, Callaghan CL, McTurk K, Lucy D, Scrimger DG. Penggunaan fosfat buffered saline untuk pemulihan sel dan spermatozoa dari usap. Sci Justice. 2006; 46 (3): 179-84. Tersedia di: ncbi.nlm.nih.gov
8. Wangen R, Aasebø E, Trentani A, dkk. Metode Pengawetan dan Pencucian Saline dengan Buffer Fosfat Mempengaruhi Protein Leukemia Myeloid Akut. Int J Mol Sci. 2018; 19 (1): 296. Tersedia di: ncbi.nlm.nih.gov
9. Martínez R, Gragera R. (2008). Landasan teoretis dan praktis dari histokimia. Dewan Tinggi Penyelidikan Ilmiah. Madrid. Tersedia di: books.google.co.ve